活性氧介导重楼皂苷诱导脑胶质瘤细胞凋亡的研究*

蔡紫微，蒋佩文，张丹莹，李敏惠，杨 平，赵 静△

1.成都医学院 基础医学院(成都610500)；2.成都医学院 检验医学院(成都610500)；3.成都医学院 药学院(成都610500)；4.成都医学院 科研实验中心(成都610500)；5.成都医学院 教务处(成都610500)

脑胶质瘤是常见的原发性恶性肿瘤，我国脑胶质瘤发病率为(5～8)/10万人，病死率仅次于胰腺癌和肺癌[1]。临床上，脑胶质瘤的治疗方式主要有手术、放化疗及免疫治疗等。由于脑胶质瘤依赖弥漫浸润性的生长模式及肿瘤本身复杂的异质性，导致以上治疗方式面临高复发率、高病死率、靶向性较低、容易产生药物抵抗等问题，使得脑胶质瘤的治疗效果仍处于较低水平[2]。据报道[3]，脑胶质瘤患者的中位生存期低于其他肿瘤疾病，5年生存率仅9%左右。为提高治疗效果、延长患者的生存期，寻找新型有效的抗脑胶质瘤药物非常必要。

甾体皂苷是由糖基和甾体皂苷元缩合而成的糖基皂苷，是多种药用植物发挥生物学功能的主要活性结构，如从百合科植物七叶一枝花或云南重楼的干燥根茎中提取出来的重楼皂苷Ⅰ(polyphyllin Ⅰ，PPⅠ)、重楼皂苷Ⅵ(polyphyllin Ⅵ，PPⅥ)、重楼皂苷Ⅶ(polyphyllin Ⅶ，PPⅦ)以及从延龄草的根和根茎中分离的重楼皂苷Ⅶ(paris saponin Ⅶ，PSⅦ)[4]。重楼皂苷类化合物具有抗菌消炎、降低血压等多种生理活性，药用价值极高。研究[5]发现，重楼皂苷类化合物在乳腺癌、肺癌、肝癌、骨肉瘤以及结肠癌中表现出明显的抗肿瘤活性，而对人脑胶质瘤的作用报道较少。据此，本研究拟探讨重楼皂苷类化合物PPⅠ、PPⅥ、PPⅦ以及PSⅦ对人脑胶质瘤细胞LN229的增殖抑制作用,及PPⅦ抑制LN229细胞增殖的效应机制，以期为抗人脑胶质瘤的治疗提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 药物

PPⅠ(Cat.No.S9114)、PPⅥ(Cat.No.S9302)、PPⅦ(Cat.No.S9515)、PSⅦ(Cat.No.S9156)购自美国Selleck公司。

1.2 肿瘤细胞

人脑胶质瘤细胞系LN229细胞，保存于成都医学院科研实验中心。根据美国组织培养库推荐的培养方法，使用含10%胎牛血清的DMEM培养基传代培养LN229细胞。

1.3 主要试剂

胎牛血清(Cat.No.10100147)、DMEM基础培养基(Cat.No.11965-092)均购自美国Gibco公司；CCK-8检测试剂盒(Cat.No.CK04)购自日本同仁化学研究所；Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒(Cat.No.KGA108-2)购自中国凯基生物公司；线粒体膜电位检测试剂盒(Cat.No.MAK160)购自瑞士Roche公司；活性氧(reactive oxygen species,ROS)检测试剂盒(Cat.No.S0033)购自中国碧云天生物技术公司。

1.4 细胞增殖抑制实验

取对数生长期的LN229细胞，以1.5×104个/孔的密度加入96孔细胞培养板中，过夜培养至贴壁；加入供试的重楼皂苷类化合物，药物浓度为20、10、5、2.5、1.25、0.625、0 μmol/L；作用24 h后，CCK-8法测定细胞OD值。用GraphPad Prism 7.0软件分析并绘制药物对LN229细胞的生长抑制曲线。

1.5 细胞内ROS检测

取对数生长期的LN229细胞，以5×105个/孔的密度加入6孔细胞培养板中，过夜培养至贴壁；加入不同作用浓度的PPⅦ(0、1、2、4 μmol/L)处理24 h；收集LN229细胞，用DCFH-DA荧光探针进行染色，流式细胞仪(ACEA NovoCyte)检测LN229细胞内ROS水平。

1.6 细胞线粒体膜电位检测

同“1.5”，PPⅦ作用后，收集LN229细胞，使用亲脂性荧光探针JC-1进行染色，通过流式细胞仪检测LN229细胞线粒体膜电位(mitochondrial membrance poteintial,MMP)的变化情况。

1.7 细胞凋亡检测

同“1.5”，PPⅦ作用后，收集LN229细胞，使用Annexin V-FITC/PI荧光染料对细胞进行染色，通过流式细胞仪检测LN229细胞凋亡率。

1.8 统计学方法

2 结果

2.1 重楼皂苷类化合物对LN229细胞增殖的影响

重楼皂苷类化合物PPⅠ、PPⅥ、PPⅦ、PSⅦ的化学结构和分子式如下，可见PPⅠ、PPⅥ及PSⅦ的母核为偏诺皂苷元，而PPⅦ的母核为薯蓣皂苷元(图1A)。CCK-8检测结果表明，重楼皂苷类化合物均以浓度依赖性的方式抑制LN229细胞增殖。GraphPad Prism 7.0软件绘制LN229细胞生长抑制曲线，求得PPⅠ、PPⅥ、PPⅦ、PSⅦ4种化合物24 h的IC50值分别为3.292、5.540、2.029、6.206 μmol/L，可见PPⅦ 的增殖抑制效果最佳(图1B)。据此，进一步探讨PPⅦ对LN229细胞发挥增殖抑制效应的机制。

图1 药物作用下人脑胶质瘤细胞LN229生长抑制曲线

2.2 PPⅦ诱导LN229细胞形态发生改变

不同浓度的PPⅦ(0、1、2、4 μmol/L)作用LN229细胞24 h后，采用倒置显微镜成像法观察LN229细胞形态的变化。研究发现，药物作用后，LN229细胞形态呈现出典型的凋亡样改变，即细胞缩小变圆、核固缩碎裂，同时细胞数量呈浓度依赖性减少(图2)。

图2 PPⅦ作用下LN229细胞形态学成像

2.3 PPⅦ对LN229细胞内ROS水平的影响

用DCFH-DA荧光探针染色LN229细胞并用流式细胞仪检测，结果发现PPⅦ增加LN229细胞内ROS水平。和对照组相比，4 μmol/L 的PPⅦ处理后，ROS水平从(1.61±0.12)%增加到(10.44±0.24)%，差异有统计学意义(P<0.05)(图3)。

图3 PPⅦ作用下LN229细胞内ROS水平检测

2.4 PPⅦ诱导LN229细胞线粒体膜电位改变

使用流式细胞仪分析经JC-1染色后的LN229细胞，发现在不同浓度的PPⅦ(0、1、2、4 μmol/L)作用下，LN229细胞MMP降低水平分别为(2.43±1.22)%、(6.05±1.37)%、(55.85±2.23)%、(85.16±1.70)%，差异有统计学意义(P<0.05)(图4)。

图4 PPⅦ作用下LN229细胞线粒体膜电位检测

2.5 PP Ⅶ诱导LN229细胞凋亡

PPⅦ处理24 h后，使用Annexin V-FITC/PI双染法对LN229细胞进行染色，并通过流式细胞仪分析PPⅦ的凋亡诱导效应，结果发现PPⅦ以浓度依赖的方式诱导LN229细胞凋亡，在0、1、2、4 μmol/L的PPⅦ作用下，细胞凋亡率分别为(3.43±1.45)%、(9.50±1.47)%、(72.47±2.54)%、(87.27±1.68)%，差异有统计学意义(P<0.05)(图5)。

图5 PPⅦ作用下LN229细胞凋亡检测

3 讨论

脑胶质瘤与周围正常组织的界限模糊，单纯的手术治疗并不能有效改变患者生存期，辅以药物治疗仍是临床上治疗脑胶质瘤的重要手段之一。由于现有药物存在高剂量、高毒性的限制和药物抵抗现象，因此迫切需要新型有效的抗肿瘤药物[6]。有研究[7-8]发现,白花丹素、黄连素、姜黄素等天然化合物有明显的抗脑胶质瘤活性，提示从天然化合物中开发新型有效的抗肿瘤药物具有重要的临床意义。本研究发现，重楼皂苷类化合物PPⅠ、PPⅥ、PPⅦ及PSⅦ均能有效抑制胶质瘤细胞LN299增殖，其中PPⅦ的增殖抑制效果更明显。

ROS是真核细胞有氧代谢产生的副产物，参与肿瘤细胞增殖与凋亡的调节[9]。线粒体作为ROS产生的重要部位，MMP的稳定和细胞内ROS水平密切相关[10]。ROS的累积能破坏线粒体膜，诱导MMP变化，而MMP 的稳定有利于维持细胞的正常生理功能[11]。此前有关PPⅦ抗肿瘤活性的报道[12]主要围绕AKT/mTOR信号通路，对ROS介导的抗肿瘤效应报道较少。有研究[13]指出，PP Ⅶ能通过ROS增加胶质瘤U87-MG和U251细胞对替莫唑胺的敏感性。由于肿瘤异质性的存在，不同肿瘤细胞间和相同肿瘤不同来源的细胞株间的基因与表型不同，导致同一种药物在不同系别的肿瘤细胞上可表现出不一样的治疗效果及预后。因此，本研究通过DCFH-DA和JC-1染色检测了LN229细胞内ROS和MMP水平，发现PPⅦ增加LN229细胞内ROS水平，并诱导LN229细胞MMP降低。此外，ROS能充当第二信使的作用，活化JNK信号通路下游的p53效应因子，最终激活促凋亡蛋白或抑制抗凋亡蛋白的转录，诱导细胞凋亡[14]。本研究通过Annexin V-FITC/PI染色，证实PPⅦ以浓度依赖的方式诱导LN229细胞凋亡，凋亡细胞比例从(3.43±1.45)%增加到(87.27±1.68)%。基于以上研究结果，推测PPⅦ可能通过ROS介导的线粒体凋亡途径诱导LN229细胞凋亡。课题组后续将进一步探讨PPⅦ作用，相关信号通路的活化及潜在作用靶点，并分析其对其他肿瘤细胞的增殖抑制作用。此研究将为临床治疗人脑胶质瘤提供新思路，同时为PPⅦ的临床应用提供新见解。