自体精液冷冻保存患者细菌感染现状及对精子冷冻的影响*

鲜 泱，蒋 敏，刘 博，赵文瑞，刘 晓，柳莎莎，李福平△

1.四川大学华西第二医院 人类精子库(成都 610041)；2.西部妇幼研究院出生缺陷与相关妇儿疾病教育部重点实验室(成都 610041)

人类精子的产生及成熟是极为复杂的过程，任何环节的异常均有可能对精子的产生及受精过程有影响，从而影响男性生育力[1]。生殖系统感染在导致男性不育的影响因素中约占4%～10%[2]，是较重要的一项指标。男性生殖道感染由细菌、支原体、淋球菌及病毒等多种病原微生物引起[3]，其中较常见的是细菌感染。精液细菌感染可能通过直接或间接方式，影响精子功能、生精功能及精子质量，从而影响辅助生殖结局[4]。在人类精子库进行自体精液保存的人群，其冷冻精子的最终用途为行辅助助孕治疗，而辅助生殖技术中导致胚胎污染的最主要因素为精液细菌感染[5-6]。因此，精液中细菌感染情况对自体精液保存患者尤为重要。本研究通过回顾性研究四川地区自精保存患者的细菌感染分布情况，分析细菌感染对精子冷冻前后参数的影响，为男性生殖健康及精子冷冻影响因素提供参考。

1 资料与方法

1.1 临床资料

回顾性分析2016年11月至2019年6月于四川大学华西第二医院人类精子库/四川省人类精子库行自精保存患者共365例，排除未冷冻患者11例，最后纳入试验对象共计355例，所有患者均签订知情同意书，研究符合伦理学要求。355例患者根据冷冻原因，分为肿瘤患者及非肿瘤患者两类，其中肿瘤患者共157例，根据是否有细菌感染分为细菌感染组18例及对照组139例。非肿瘤患者共198例，根据是否有细菌感染分为细菌感染组27例及对照组171例。157例肿瘤患者根据不同肿瘤类型，分为睾丸肿瘤组41例、血液肿瘤组45例及其他肿瘤组71例。

1.2 方法

1.2.1 精液标本采集及检测 患者禁欲2～7 d，于四川省人类精子库独立取精室内手淫法取精，收集完整的标本置于无菌取精杯内。精液标本置于37 ℃恒温孵箱内，液化后，移液器吸取7 μL标本至Makler板上，计数精子浓度及前向运动精子(progressive motility,PR)比例，每份标本计数2次，每次至少计数200条精子，2次结果满足95%可信区间即取均值作为检测结果，所有操作均严格按照WHO《人类精液检查与处理实验室手册》(第五版)[7]要求进行。

1.2.2 精液标本冷冻及复苏方法 1)冷冻方法：采用自配的无菌含甘油不含卵黄的改良Tyrode's液，按冷冻比例为1∶3(甘油终浓度为7%)缓慢沿杯壁加入冷冻保护剂，混匀后，分装至高安全性密封冻存管中，每支标本1 mL，用冻存管封口仪密封冷冻管。采用冷平衡法进行冷冻，4 ℃冰箱平衡15 min后，置于液氮上5 cm平衡10 min，随后浸入液氮。2)复苏方法：将标本从液氮中取出，室温平衡1 min后，置于37 ℃水浴箱孵育5 min后进行浓度及PR%的镜检。3)细菌培养：精液液化后分装至无菌拭子，及时送至检验科微生物室，标本接种于哥伦比亚血平板(广州迪景)上，置于5%CO2孵箱35 ℃孵箱18～24 h后，据菌落形态及涂片革兰染色结果选择相对应的细菌鉴定及药敏卡，使用仪器为梅里埃公司VITEK2COMPACT全自动细菌鉴定及药敏分析系统。相应质控菌株由卫生部临检中心提供。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 自精保存患者细菌感染分布情况

355例患者中共有45例患者有细菌感染，阳性率12.68%。其中，阴道加德纳菌感染21例，占细菌感染比例46.67%；B群链球菌(无乳链球菌)7例，占细菌感染比例15.56%；粪肠球菌4例，占细菌感染比例8.89%；大肠埃希菌3例，占细菌感染比例6.67%；金黄色葡萄球菌2例，占细菌感染比例4.44%；草绿色链球菌、肺炎克雷伯菌、柯氏枸橼酸杆菌、摩氏摩根菌、溶血葡萄球菌、偌伊放线菌、阴沟肠杆菌、混合菌丛(咽峡炎链球菌，少量；缓症链球菌，少量)各1例，分别占细菌感染比例2.22%(图1)。

图1 自精保存患者细菌感染的分布

2.2 自精保存患者细菌感染与精液质量及冷冻效果间的关系

2.2.1 非肿瘤患者细菌感染与精子冷冻的关系 非肿瘤患者共198例，其中，细菌感染组27例，中位数年龄为29岁，中位数精液体积为2.9 mL。对照组171例，中位数年龄为31岁，中位数精液体积为3.2 mL。两组间一般情况比较，差异无统计学意义(P>0.05)。冷冻前细菌感染组及对照组中位数浓度分别为41.0×106/ mL和61.0×106/ mL；中位数PR为50.0%、59.0%。冷冻后两组间中位数浓度为29.0×106/mL和45.0×106/mL，中位数PR分别为33.0%和40.0%，中位数复苏率分别为62.2%和66.2%，细菌感染组及对照组上述指标比较差异无统计学意义(P>0.05)。冷冻后细菌感染组及对照组中位数前向精子总数(TMC)=浓度×PR×体积，分别为11.2×106/mL和16.2×106/mL，两组间比较差异有统计学意义(P<0.05)(表1)。

表1 非肿瘤自精保存患者细菌感染与精液质量及冷冻效果的关系

2.2.2 肿瘤患者细菌感染与精子冷冻的关系 肿瘤患者共157例，其中，细菌感染组18例，中位数年龄为31.5岁，中位数精液体积为3.4 mL。对照组139例，中位数年龄30.0岁，中位数体积为3.1 mL。两组间一般情况比较差异无统计学意义(P>0.05)。冷冻前细菌感染组及对照组精液质量比较差异无统计学意义(P>0.05)。冷冻后两组间复苏浓度、PR、TMC比较差异有统计学意义(P<0.05)(表2)。

表2 肿瘤自精保存患者细菌感染与精液质量及冷冻效果间的关系

2.2.3 不同类型肿瘤患者精液质量与冷冻效果比较 157例肿瘤患者以血液肿瘤患者最多(28.7%)，其次为睾丸肿瘤(26.1%)，其他类型肿瘤(45.2%)。根据不同肿瘤类型将肿瘤患者分为睾丸肿瘤组、血液肿瘤组及其他肿瘤组。冷冻前睾丸肿瘤组、血液肿瘤组及其他肿瘤组的精液平均浓度及PR比较，差异无统计学意义(P>0.05)。复苏后，睾丸肿瘤组、血液肿瘤组及其他肿瘤组的精液平均浓度、PR、复苏率及TMC比较，差异无统计学意义(P>0.05)(表3)。

表3 不同类型的肿瘤患者精液质量与冷冻效果比较

3 讨论

男性生殖道感染可能导致尿道炎、精囊炎、前列腺炎等一列炎症反应，从而影响精液质量，诱发主动免疫反应，继而导致精子的生成及成熟障碍[8]。男性生殖道感染中，细菌感染为较重要的影响因素，泌尿道的细菌感染主要通过对精液的液化时间及精子运动的影响从而影响男性生育力[9]。人类精子库的基本任务之一就是为有生育力保存需求的男性提供生殖保险，在精子库冷冻保存的精子最终用于辅助助孕治疗。既往研究[10]发现，在体外受精-胚胎移植(IVF-ET)过程中，精液细菌污染可能会导致卵子不受精、受精卵不分裂、胚胎死亡等，导致IVF-ET失败，在体外受精过程中，虽然胚胎污染率较低仅0.51%[6]，但其最可能的来源为精液的细菌污染[5]。因此，精液细菌感染检测对自精保存患者具有重要的临床意义。

本研究发现，自体精液保存患者的细菌感染比例为12.68%，细菌感染以革兰阳性菌为主，最常见为阴道加德纳菌，其次为B群链球菌、粪肠球菌及大肠埃希菌，这一结果与陈静华等[11]报道的IVF-ET患者精液细菌感染以革兰阳性球菌及杆菌为主一致。国内研究[12]报道，精液在排出过程中易受到尿道常居菌如葡萄球菌、链球菌等污染，因此，认为精液中检出革兰阳性球菌无较大的临床意义，精液中细菌感染应以革兰阴性杆菌为主。此后，随着对精液细菌认识的增加，革兰阳性菌应该为条件致病菌，可能原因为目前由于临床上病例大部分经过抗菌药物的经验性治疗，导致抑制或杀灭常见的革兰阴性菌的同时，使革兰阳性菌大量增殖引起病变，从而使革兰阳性菌成为男性不育的重要致病菌[13]。

前往精子库进行精子冻存的人群主要分为肿瘤患者和非肿瘤患者两大类。肿瘤患者由于其疾病或治疗如放化疗等原因影响，其精液质量明显低于非肿瘤患者[14-16]，本研究分别比较细菌感染对这两种人群精子冷冻的影响。精液中的细菌可通过增加精子的凝集效应，降低精子的活动能力及穿透宫颈能力，改变精浆微环境的一系列作用，影响精子质量及运动能力[17]。本研究发现，无论是肿瘤患者还是非肿瘤患者，细菌感染组冷冻前精子的浓度及PR均低于对照组，但差异无统计学意义(P>0.05)；在肿瘤患者中，细菌感染组复苏后浓度、PR及TMC均明显低于对照组(P<0.05)，在非肿瘤患者中，细菌感染组冷冻复苏后TMC明显低于对照组(P<0.05)。研究[18-19]报道，精液中的细菌可导致精子浓度、运动能力减弱。本研究结果表明，精液中细菌感染虽在冷冻前对精子的浓度及PR无明显影响，但会造成精子冷冻效果下降，特别是在本身精液质量较差的肿瘤患者中尤为明显。在男性肿瘤患者中，对于睾丸肿瘤患者，由于其肿瘤生长可能侵袭至正常的睾丸组织，继而对局部微环境进行破坏，对睾丸在性腺轴上的功能产生影响，从而导致生精功能下降[19]，而血液肿瘤患者则为在精子库保存的数量最多的一类肿瘤患者。既往研究[20]指出，血液肿瘤会导致患者精液质量下降。本研究将肿瘤患者分为睾丸肿瘤组、血液肿瘤组及其他肿瘤组，冷冻前睾丸肿瘤患者、血液肿瘤及其他类型肿瘤患者精液质量差异无统计学意义(P>0.05)；睾丸肿瘤患者的冷冻复苏率及TMC均低于血液肿瘤患者及其他肿瘤患者，差异无统计学意义(P>0.05)，但亦可看出降低趋势。

综上所述，自精保存患者细菌感染比例较高，且精液细菌感染有导致精子冷冻效果下降及后续使用的风险，建议细菌感染患者在进行生育力保存前先进行治疗，转为阴性后，再进行精子冷冻保存。