肝硬化门静脉高压动物模型的实验对比研究

胡豆豆 任万雷 仇莎 姜相君

门静脉高压症迄今尚无有效的治疗方法，建立适合的门静脉高压动物模型对研究门静脉高压的发病机制及其治疗意义重大。目前建立门静脉高压动物模型的方法有很多，各具优缺点。本研究将对四氯化碳(CCl4)化学损伤性以及胆管结扎(BDL)机械梗阻性大鼠门静脉高压模型进行研究，分析其在门静脉高压形成过程中的特点，为后续实验开展提供准确的方法。

材料与方法

一、实验动物

雄性Wistar大鼠，清洁级，体质量200～220 g，饲养温度 20～25 ℃，相对湿度40%～70%，每日光照12 h。用杆状饲料喂养，去离子水装入水瓶供动物自由饮用。购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证编号No SCXK(京)2006-2009。实验动物饲养于青岛大学SPF级实验动物房，许可证号：12-1004。本研究方案经青岛市市立医院伦理委员会审批，符合实验室动物管理与使用准则。

二、研究方法

(一)CCl4模型建立 将大鼠随机分为CCl4组(n=6)及对照组(n=6)。CCl4组：腹腔注射40% CCl4(CCl4：橄榄油=比例2∶5 mL)0.2 mL/100 g，每周2次，共注射12周。分别于造模后4周、8周、12周测量门静脉压力、取大鼠肝脏、脾脏标本。对照组：按照0.2 mL/100 g剂量给予腹腔注射橄榄油溶液，每周2次，共注射12周。分别于注射后4周、8周、12周测量门静脉压力、取肝脾组织标本。

(二)BDL模型建立 将大鼠随机分为BDL组(n=6)和假手术组(n=6)。BDL组：禁食不禁水12 h，0.2%苯巴比妥钠腹腔注射麻醉，剂量为0.1 mL/100 g，沿着腹白线剪开进入腹腔，游离胆总管，分别在上、下游相隔1.5 cm的两处结扎，并在结扎中间剪断，分层缝合。分别于造模后4周、8周、12周测量门静脉压力、取大鼠肝脏、脾脏标本。假手术组：麻醉后打开腹腔，充分暴露及游离胆总管，不结扎胆总管, 于造模后4周、8周、12周测量门静脉压力，取大鼠肝脏、脾脏标本。

三、观察指标

(一)一般情况 观察大鼠皮毛色泽、黄疸以及活动情况。

(二)测量大鼠门静脉压力 大鼠皮下注射0.2%苯巴比妥钠麻醉，剂量为0.1 mL/100 g；将大鼠腹部剃毛后固定于鼠板上，沿着腹白线剪开进入腹腔，在肠系膜后静脉起始部分离出6～8 mm长的肠系膜后静脉，将周围组织清除干净；分离干净后在血管上段和下段各穿一根手术缝线，用穿线结扎肠系膜后静脉的最下端，前段扎线用于插管后固定穿刺针；选择分离干净的肠系膜后静脉，用充满3%肝素生理盐水的穿刺针从肠系膜后静脉缓慢插入，一直插到门静脉主干，用预留的结扎线固定导管，连接BL-420S生物机能系统，测量10 min，取平均值。

(三)肝脏大体标本及病理学分析 将取出的肝脏固定、包埋、切片，进行天狼猩红染色，后进行脱水、透明、封片，光镜下观察。

(四)体质量、肝脏湿重和脾脏湿重 在测量门静脉压力前先对大鼠进行称重并记录体质量。门静脉测压结束后，分别取出大鼠的肝脏、脾脏，称重并记录。

四、统计学处理

采用 SPSS 22.0统计软件进行数据统计分析，正态分布的资料以(均数±标准差)表示，两组比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、动物的一般情况

对照组大鼠毛发柔顺有光泽、活动自如、摄食正常。CCl4组大鼠在整个造模过程中食欲减退、皮毛枯槁、活动减少、懒动喜卧。与假手术组相比，BDL组大鼠最突出的特点是皮肤和毛发黄染，以耳部及尾部最为明显，且尿色发黄。

二、门静脉压力的变化

正常大鼠门静脉压力为 6～7 mmHg，与人的门静脉压力值相近。CCl4组，在整个造模过程中，门静脉压力呈逐渐升高趋势，与对照组比，造模4周时门静脉压力轻度升高，造模8周、12周时门静脉压力则明显升高且有统计学差异(P<0.05)(表1)，造模12周部分大鼠有腹水、肠系膜侧枝循环形成等表现。与CCl4组相比较，BDL组门静脉压力却呈现短期迅速升高趋势。造模4周，大鼠门静脉压力明显升高，高达(16.15±1.61)mmHg。造模8周、12周时门静脉压力分别为(16.69±2.10)mmHg、(16.21±3.44)mmHg，与假手术组相比有统计学差异(P<0.05)(表2)。

表1 CCl4组不同阶段大鼠各项指标比较结果(均数±标准差)

表2 BDL组不同阶段大鼠各项指标比较结果(均数±标准差)

三、肝脏大体标本观察

正常大鼠肝脏分六叶，表面光滑、边缘锐利、质地柔软、色泽红润。CCl4组随着纤维化程度加重，肝叶变形、边缘变钝，肝叶之间粘连，伴脂质沉积。造模后期肝脏体积明显缩小，质硬，呈结节状。BDL组大鼠肝脏体积增大，肝叶形态尚存，肝脏表面呈现暗黄色。造模后期肝叶质地变硬，边缘变钝，表面呈深褐色，甚至黄绿色(图1)。

四、肝脏湿重和脾脏湿重变化

从图1可以看出，CCl4组造模初期，主要表现为肝叶变形、粘连。造模12周时，随着纤维化程度加重，肝脏表面呈颗粒状，肝脏湿重较对照组明显增加(P<0.05)。而BDL组，由于胆总管被截断，肝内胆汁淤积、胆管增生，肝叶体积增大更为明显，造模4周、8周及12周较对照组均明显增加且有统计学意义(P<0.05)。

图A为对照组大鼠肝脾大体图像；图B-D分别为CCl4造模4周、8周、12周大鼠肝脾大体图像；图E为假手术组大鼠肝脾大体图像；图F-H为BDL术后4周、8周、12周大鼠肝脾大体图像。

CCl4组，门静脉压力随着造模时间逐渐升高，脾脏质量亦是逐渐增加的，造模8周、12周时脾脏质量逐渐增加，较对照组有统计学差异(P<0.05)。而BDL组，造模4周时，脾脏重量较假手术组就有明显增加，造模8周、12周时与假手术组比较仍有明显统计学差异(P<0.05)。可见，不论在CCl4组还是BDL组，脾脏质量与门静脉压力升高趋势是一致的。

五、病理观察

正常肝小叶结构清晰，门静脉及中央静脉周围有少许被天狼猩红染色的胶原组织。CCl4组造模4周可见纤细的汇管区-汇管区(P-P)、汇管区-小叶中央(P-C)纤维间隔形成；造模8周时可见纤维间隔进一步分割肝实质；造模12周时大鼠肝脏小叶结构紊乱，假小叶形成。BDL组造模4周汇管区可见大量胆管样上皮细胞增生，并延伸至小叶内；造模8周可见汇管区扩大，增生的间隔相互连接；造模12周时肝组织满布增生的胆管，肝实质包绕、分割，小叶结构破坏(图2)。

图A-C分别为CCl4模型组4周、8周、12周大鼠肝脏病理图像(天狼猩红染色)；图D-F分别为BDL 模型组4周、8周、12周大鼠肝脏病理图像(天狼猩红染色)

讨 论

门静脉高压症是慢性肝病肝硬化患者死亡的主要原因[1-2]，门静脉压力数值是决定肝纤维化分级、评价预后、指导治疗的重要指标[3]。目前对门静脉高压症仍缺乏有效的治疗手段，而门静脉高压动物模型的建立可对研究门静脉高压症的发病机制、治疗作用等提供重要的实验载体。常见的门静脉高压动物模型有以下几种[4-5]：CCl4门静脉高压模型、BDL门静脉高压模型、硫代乙酰胺(TAA)门静脉高压模型、二甲基亚硝胺(DMNA)门静脉高压模型、血栓栓塞门静脉高压模型等。其中，以CCl4门静脉高压模型及BDL门静脉高压模型在临床研究中最为常见，但目前关于两者门静脉压力的变化尚缺乏系统的研究。

肝硬化时，肝内阻力增大是门静脉高压发生的始发因素，也是主要因素[6-8]。当CCl4进入体内可导致肝细胞变性、坏死[9]，反复给药导致正常肝细胞结构破坏，增生的纤维组织包绕分割形成假小叶。在CCl4模型中，胶原纤维增生及再生结节压迫可使肝内阻力逐渐增大，门静脉压力缓慢升高。而在BDL组中，由于人为截断胆总管，使肝内胆汁淤积、胆管扩张，压迫门静脉。此外，增生的胆管还可直接压迫肝血窦，共同导致门静脉高压的形成[10]。可见BDL模型门静脉压力是骤然升高，后期侧支循环仍无法有效建立，门静脉高压一直维持。

脾大不仅仅是门静脉高压症的一个重要临床表现，还是判断门静脉压力高低的一个重要指标[11]。Berzigotti等[12-13]提出将肝脏弹性值、血小板数量与脾脏直径联合起来能很好地预测临床显著门静脉高压症及食管静脉曲张的发生，并且对脾脏直径的无创性监测可以对肝硬化患者进行预后分层。Hayashi等[14]将脾脏大小与血清胆汁酸水平联合起来，从而能够很好地预测门静脉压力。从笔者的研究中可以看出，脾脏质量与门静脉压力变化趋势是一致的。在CCl4组，脾脏质量随着造模时间逐渐增加。而BDL组，造模4周时脾脏质量明显增加，是假手术组的3倍，这与人类胆汁淤积型肝硬化是不谋而合的。研究发现原发性胆汁性胆管炎(primary biliary cirrhosis, PBC)患者在肝硬化之前就已经有脾大[15]。此外，对比两种模型同期脾脏质量，发现BDL组脾脏质量要高于CCl4组。Terayama 等[15]曾对184例PBC患者及41例非胆汁淤积型肝硬化患者脾脏质量进行了比较，PBC患者脾脏质量为(450±224)g，要明显重于非胆汁淤积型肝硬化患者，这与笔者的研究结果是一致的。

本研究的意义是对比分析了CCl4模型以及BDL模型在门静脉高压形成过程中的特点，使人们对不同原因肝硬化门静脉压力的变化有更深入、更具体的认识。同时也对两种动物模型进行了系统的分析，为临床研究中实验模型的选择提供理论依据。本文的研究并不是终点，以后笔者将围绕现象背后的机制展开研究，知其然更需知其所以然。