原发性肝癌患者LncRNA-MEG3表达与临床病理特征及预后的关系

侯亚萍 张小晶 李婷

原发性肝癌是消化系统较常见的恶性肿瘤之一，该疾病在早期缺乏明显症状，极易被忽视，发现时患者多已处于中晚期，具有发病率高、预后较差、死亡率高等特点[1-2]。目前，临床上治疗原发性肝癌的方法多样，但患者预后较差。因此，探讨该疾病的发病机制对患者的治疗及预后评估具有重要的意义。长链非编码RNA人母系表达基因(Long non-coding RNA maternally expressed gene3，LncRNA-MEG3)是一种定位于人类染色体14q32.3中的印记基因[3-4]，研究表明LncRNA-MEG3高表达可抑制肝癌细胞增殖，促进细胞凋亡[5]。本研究拟通过检测原发性肝癌患者血清LncRNA-MEG3的表达情况，并探究其表达水平与原发性肝癌患者预后的关系，以期为临床治疗原发性肝癌提供有价值的参考依据，现报道如下。

资料与方法

一、一般资料

选取2015年4月至2016年11月西京医院收治的原发性肝癌患者68例为原发性肝癌组，其中男39例，女29例，年龄38～65岁，平均年龄(51.34±4.73)岁。同期选取在本院进行常规体检的健康人群70例为对照组，其中男38例，女32例，年龄36～65岁，平均年龄(50.96±5.02)岁。按照国际抗癌联盟及美国癌症联合会(UICC/AJCC)制定的原发性肝癌临床分期标准进行分期[6]：Ⅰ-Ⅱ期30例，Ⅲ～Ⅳ期38例。原发性肝癌组及对照组之间年龄、性别等一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

原发性肝癌组纳入标准：①符合原发性肝癌的相关诊断标准[7]；②患者及家属选择在本院接受治疗者；③临床资料完整者。排除标准：①出现合并性脑病者；②同时患有其他恶性肿瘤者；③临床随访资料不全者。

该研究经本院道德伦理委员会批准通过，所有样品采集均取得患者及家属知情并签署同意书，且符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》。

二、主要试剂与仪器

离心机(货号：4-TK)，购自湖南恒诺仪器设备有限公司；RNA提取试剂盒(货号：DP419)，购自北京天根生化科技有限公司；逆转录试剂盒(货号：KL266)，购自上海康朗生物科技有限公司；实时荧光定量PCR仪(货号：V115896)，购于美国应用生物系统公司；LncRNA-MEG3及GAPDH引物，由北京宝日医生物技术有限公司合成；本研究中其他化学药品均购自北京甘棠飞华生物科技有限公司。

三、研究方法

于清晨抽取所有受试者空腹状况下的静脉血5 mL，离心分层后收集上层血清，置于-20℃冰箱中保存待测。

采用实时荧光定量PCR法(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)检测所有研究对象血清LncRNA-MEG3的表达水平。具体步骤为：取待测血清，使用RNA提取试剂盒并严格按照说明书步骤进行操作，提取总RNA，然后经逆转录得到cDNA。以逆转录合成cDNA为模板，进行qRT-PCR检测。PCR反应条件如下：95℃，180 s；95℃，15 s；60℃，75 s；95℃，15 s；共38个循环。血清LncRNA-MEG3及内参GAPDH的上下游引物序列见表1。采用2-ΔΔCT法计算血清LncRNA-MEG3相对表达量。每个反应重复3次取平均值。

表1 引物序列

四、随访

对本研究中涉及的所有患者治疗出院后进行门诊复查或电话随访，并根据相关标准对患者预后进行评估，随访时间为3年，末次随访时间为2019年11月30日，死亡患者以死亡时间作为随访截止期，并做好记录，本次随访的中位随访时间为1.42年，且本研究中未出现失访情况。

五、统计学分析

结 果

一、两组血清LncRNA-MEG3表达水平比较

原发性肝癌组(0.86±0.25)血清LncRNA-MEG3表达水平显著低于对照组(1.24±0.37)(t=0.705，P<0.05)。

二、LncRNA-MEG3表达水平与原发性肝癌临床病理特征的关系

以血清LncRNA-MEG3表达水平的平均值(0.93)将原发性肝癌患者分为两组，高于平均值为高表达组，低于平均值为低表达组。原发性肝癌患者血清LncRNA-MEG3表达与原发性肝癌临床分期、分化程度及肝硬化密切相关(P<0.05)，而与患者性别、年龄、肿瘤直径无明显相关性(P>0.05)。详见表2。

表2 LncRNA-MEG3表达与原发性肝癌临床病理特征之间的关系[n(%)]

三、LncRNA-MEG3表达与患者预后的关系

对本次68例原发性肝癌患者随访时间3年，生存30例，总生存率44.1%。绘制原发性肝癌患者治疗后1～36个月LncRNA-MEG3高、低表达组的生存曲线。LncRNA-MEG3高表达组治疗后3年总生存率为58.3%(21/36)，95%CI：28.731～33.474；LncRNA-MEG3低表达组治疗后3年总生存率为28.1%(9/32)，95%CI：24.088～30.025。两者比较Log-rank值为6.146，P值为0.013，见图1。

图1 原发性肝癌患者LncRNA-MEG3表达3年生存曲线

四、影响脑膜瘤患者预后的因素分析

单因素分析显示，LncRNA-MEG3低表达、临床分期、分化程度及肝硬化均是影响原发性肝癌患者预后的危险因素。多因素分析显示，LncRNA-MEG3低表达和临床分期是影响原发性肝癌患者预后的独立危险因素(HR=2.500，95%CI为1.624～3.849；HR=2.024，95%CI为1.307～3.135，P均<0.05)。详见表3。

表3 影响原发性肝癌患者预后的因素分析

讨 论

原发性肝癌是消化系统常见恶性肿瘤，发病较隐匿，当患者肝区出现明显疼痛、腹水、黄疸等症状去医院就诊时，已处于中晚期，虽进行及时有效治疗，但患者的预后仍较差[8-9]。流行病学显示，原发性肝癌死亡率居各种癌症第二位，且发病率呈明显上升趋势，威胁生命健康安全，并带来沉重经济负担[10]。因此，探究与原发性肝癌预后相关的影响因子，对改善原发性肝癌预后有一定意义。

长链非编码RNAs(long non-coding RNA, LncRNAs)是一类自身缺乏编码蛋白能力的RNA分子，近年来发现LncRNA可参与机体多种生物学过程，并在多种癌症及各种疾病的发生和发展中发挥重要作用[11-12]。有研究发现LncRNA在原发性肝癌的发生及发展中起重要作用。方长英等[13]研究发现，长链非编码RNA外泌体复合物7(LncRNA EXOC7)在肝癌组织中高表达，且其表达水平与原发性肝癌患者的预后密切相关。LncRNA-MEG3是一种单拷贝印记基因，也是近年来新发现的一种具有肿瘤抑制功能的LncRNA[14-15]。研究显示，LncRNA-MEG3与多种疾病的发生发展有关。孙旭等[16]研究发现，LncRNA-MEG3在鼻咽癌组织和细胞系中低表达，且其表达水平与miR-7-5P水平密切相关。陈晓雷等[17]研究发现，雷公藤红素可通过上调LncRNA-MEG3的表达来抑制肝癌HepG2细胞增殖，进而促进细胞凋亡。然而有关LncRNA-MEG3对原发性肝癌预后影响的研究甚少。本研究结果显示，原发性肝癌组血清LncRNA-MEG3表达水平显著低于对照组，提示LncRNA-MEG3可能参与原发性肝癌的发生发展。进一步研究发现，原发性肝癌患者血清LncRNA-MEG3表达与临床分期、分化程度及肝硬化密切相关。生存曲线分析表明，LncRNA-MEG3低表达组治疗后3年总生存率低于LncRNA-MEG3高表达组，提示LncRNA-MEG3表达水平可为原发性肝癌患者预后的预测提供参考。单因素分析显示，LncRNA-MEG3低表达、临床分期、分化程度及肝硬化均是影响原发性肝癌患者预后的危险因素。多因素分析显示，LncRNA-MEG3低表达和临床分期是影响原发性肝癌患者预后的独立危险因素，提示提高LncRNA-MEG3表达可能有助于缓解原发性肝癌病情的发展，有利于患者预后。

综上所述，LncRNA-MEG3在原发性肝癌患者血清中的表达水平明显降低，且与患者临床分期、分化程度及肝硬化有关，其表达水平与患者预后密切相关，提示LncRNA-MEG3或许可作为原发性肝癌病情评估及不良预后预测的潜在生物学指标，但其具体的作用机制还有待深入研究。