肝移植术后黄疸患者肝组织的胆汁酸外排转运蛋白的表达

周丽娜 李东良 潘晨 林春 吴海聪 周晓玲

目前肝移植已被公认为治疗终末期肝病最可靠的治疗手段之一[1]，但肝移植后黄疸很常见,Hubscher SG等报道在非选择性肝穿刺病理活检中高达55%～90%的移植肝都可出现不同程度的肝内胆汁淤积[2]，部分患者伴随不可逆的肝脏损害，甚至可致受体死亡或移植肝无功能，需要再次肝移植[3-5]。且其病因复杂又可能同时并存，确切发生机制仍不明确。近期大量胆汁淤积的动物模型研究表明肝细胞毛细胆管膜上的转运蛋白可能与肝内胆汁淤积的发病机制有一定的关系，但缺乏在人体肝组织中的表达数据。本研究主要观察肝移植术后黄疸患者肝组织外排转运蛋白BSEP、MRP2和MDR3蛋白的表达变化，试图探求肝移植术后黄疸的发生机制，为其靶向性精准治疗提供理论依据。

资料与方法

一、研究对象

收集2006-2017年南京军区福州总医院肝移植术后新发黄疸并行肝穿刺活组织检查的患者25例，同时选择同期行肝血管瘤手术且肝功正常的患者18例并取其瘤旁正常肝组织。该研究经医院医学伦理委员批准。

二、实验试剂

苏木素-伊红染色液、10%过氧化氢等试剂均为实验室内自配试剂。免疫组化一抗BSEP鼠单克隆抗体BSEP(F-6)：sc-74500(美国Santa Cruz公司1∶200)、MRP2鼠单克隆抗体(英国Abcam 1∶200)、MDR3兔多克隆抗体(英国Abcam 1∶50)二抗EliVisionTM plus 试剂盒、山羊血清封闭液、AEC 显色和封片剂、0.01 M 柠檬酸-柠檬酸盐修复液(pH 6.0)、0.01 MPBS(pH 7.4)、多聚赖氨酸防脱片剂等均购自迈新生物技术有限公司。

三、实验方法

所有病例组及对照组标本均使用16G肝穿针，活检取肝组织标本，经40 g/L中性甲醛溶液固定，石蜡包埋，连续切片3 μm厚。肝脏标本全部做HE染色、BSEP、MRP2、MDR3免疫组化染色。免疫组化结果判定采用半定量分析方法：以染色强度结合阳性细胞数百分比综合计分。

四、统计学方法

结 果

一、研究对象的基本资料

25例肝移植术后黄疸的患者中，男性23例(92.0%)，女性2例(8.0%)，平均年龄46.2±12.3岁，发生肝功异常的时间为96(22,360)天。对照组12例，其中男性11例(61.1%)，女性7例(38.9%)，平均年龄44.7±13.7岁。肝移植组与对照组性别、年龄相比无统计学差异(χ2=4.721，P=0.094，t=-0.395，P=0.695)。回顾性分析25例肝移植术后黄疸的患者的病史资料及肝穿病理结果，其病因分类主要为肝移植术后急慢性排斥反应15例(39.47%)、缺血再灌注损伤4例(10.53%)、药物毒物中毒6例(15.79%)、病毒性因素5例(13.16%)、胆管阻塞8例(21.05%)等。

二、肝移植术后黄疸组与正常对照组生化指标对比

肝移植术后胆汁淤积组和正常对照组的肝功能指标ALT、AST、ALP、γ-GT、TBil、DBil相比均有统计学意义(P均<0.001，表1)。

表1 肝移植胆汁淤积组与正常对照组生化指标Kruskal-Wallis H检验

三、肝移植组和对照组肝组织中BSEP、MRP2、MDR3的表达情况

(一)BSEP 正常对照组BSEP呈强阳性表达100%(18/18)，表达于细胞膜，呈棕褐色或棕黄色，着色规则均一(图1A、1C)。肝移植术后黄疸组的表达率降低，强度减弱，在肝细胞膜上呈弱阳性表达，染色浅、着色较细、短且分布较为不均匀，部分稀疏或不表达(图1B、1D)。

A. 正常对照组肝组织BSEP免疫组化染色(×100); B.肝移植术后胆汁淤积组BSEP免疫组化染色(×100); C. 正常对照组肝组织BSEP免疫组化染色(×400); D．肝移植术后胆汁淤积组BSEP免疫组化染色(×400)

显著性水平P<0.05。正常参考值：ALT：7～40 IU/L；AST：13～35 IU/L；ALP：50～135 IU/L；γ-GT：7～45 IU/L；TBil：0～26 μmol/L；DBil：0～8 μmol/L。

(二)MRP2 正常对照组MRP2呈强阳性表达，表达率100%(18/18)，表达于肝细胞膜，呈棕褐色或棕黄色，分布规则(图2E、2G)。肝移植术后黄疸组MRP2表达强度下降，也主要表达于肝细胞膜上，染色较淡、着色部分较细短、分布较为不均(图2F、2H)。

A.正常对照组肝组织MRP2免疫组化染色(×100); B. 肝移植术后胆汁淤积组MRP2免疫组化染色(×100); C. 正常对照组肝组织MRP2免疫组化染色(×400); D. 肝移植术后胆汁淤积组肝组织MRP2免疫组化染色(×400)

(三)MDR3 正常对照组MDR3呈强阳性表达，表达率100%(18/18)，只表达于肝细胞膜上，呈棕褐色或棕黄色，着色均一(图3I、3K)。而肝移植术后黄疸组MDR3表达异常，除了表达强度减弱外，在肝毛细胆管周围及肝细胞膜附近的细胞质也见到表达，甚至部分沿毛细胆管着色加重形成明显的毛细胆管轮廓，染色强于细胞膜和附近的胞浆(图3J、3L)。

A.正常对照组肝组织MDR3免疫组化染色(×100); B.正常对照组肝组织MDR3免疫组化染色(×400); C.肝移植术后胆汁淤积组肝组织MDR3免疫组化染色(×100); D.肝移植术后胆汁淤积组肝组织MDR3免疫组化染色(×400)

四、BSEP、MRP2、MDR3在不同肝组织中的表达差异

通过半定量分析方法判定免疫组化结果，然后对其排秩后采用秩和U检验比较三种抗体在肝移植组和对照组的表达差异，并对肝移植术后导致黄疸的各种病因进行分类，分别探讨各病因下三种抗体的表达差异。

BSEP在肝移植组肝组织中的表达较正常肝组织的表达下降，差异均存在统计学意义(Z=-3.831，P<0.001)，但不同病因所致肝移植术后黄疸的肝组织中BSEP的表达存在差异。其中，肝移植术后排斥反应、病毒性因素及胆管阻塞等病因所致黄疸的肝组织中BSEP的表达较正常肝组织的表达明显下降，差异具有统计学意义(分别为P<0.001、P=0.002、P=0.035)，而缺血再灌注损伤、药物毒物所致移植后黄疸较正常组差异不显著(分别为P=0.189、P=0.081)(表2)。

MRP2在肝移植组和对照组中的表达存在统计学差异(Z=-2.128，P=0.033)，但在不同病因所致肝移植术后黄疸的肝组织中的表达不同：除病毒性因素所致肝移植术后黄疸的肝组织中MRP2的表达较正常肝组织的表达下降外(P=0.012)，肝移植术后排斥反应、缺血再灌注损伤、药物毒物及胆管阻塞等因素所致肝移植后黄疸的肝组织中MRP2的表达较正常组的差异并无统计学意义(分别为P=0.059、P=0.145、P=0.480、P=0.074)(表2)。

MDR3在肝移植术后黄疸的肝组织中的表达较正常肝组织中的表达亦下降，差异存在统计学意义(Z=-3.321，P=0.001)。其中，肝移植术后排斥反应(P=0.001)、缺血再灌注损伤(P=0.011)、药物毒物(P=0.047)及阻塞性因素(P=0.013)所致移植后黄疸的肝组织中MDR3的表达较正常对照组存在统计学差异，但病毒性因素所致者MDR3的表达较对照组差别无统计学意义(P=0.061)(表2)。

表2 BSEP、MRP2、MDR3在不同病因的肝移植术后黄疸的肝组织中的表达差异

讨 论

移植术后黄疸是肝移植术后常见的并发症之一，其病因复杂多样且可能同时存在，目前发病机制仍不十分明确。近期较多动物研究实验显示，胆汁酸盐转运蛋白的表达功能异常或异位可能导致多种胆汁淤积性肝病的发生。因此我们通过人肝移植术后伴有黄疸患者的肝组织标本，观察BSEP、MRP2和MDR3蛋白的总体表达变化及不同病因导致的肝移植术后黄疸的患者中上述抗体的表达差异。

本研究发现，BSEP在肝移植术后黄疸患者的肝组织上表达减弱，半定量计分方法显示BSEP表达量与正常对照组相比差异具有统计学意义。进一步病因分析发现，BSEP在肝移植术后排斥反应、病毒性因素及阻塞性病因所致的黄疸患者的肝组织中较正常组均明显下降，差异有统计学意义。这与大多数动物实验中发现Bsep基因的转录及蛋白的表达水平明显下降相一致[6-7]，推测可能是BSEP基因表达水平下降或不足导致胆汁酸在肝细胞内蓄积，进而损害到肝细胞膜的生理功能[8]。但在缺血再灌注、药物毒物中毒所致肝移植术后黄疸的肝组织上表达较正常对照组下降不明显。张宝良[9]在大鼠供肝热缺血损伤的实验研究中亦发现在肝移植术后相同时点不同供肝热缺血时间的移植组间的BSEP mRNA转录水平和蛋白表达水平无明显差别。Luigi Accatino等[10]在大鼠肝脏热缺血再灌注损伤中也未发现上述该转运蛋白的降低，与本实验结果一致。Andreas Geier等[11]发现四氯化碳致急性毒性肝损伤时，大鼠注射CCl4后24 h、72 h测定小管MRP2和BSEP的mRNA水平没有变化。

肝移植术后黄疸组较正常对照组之间MRP2的表达亦存在统计学差异，但进一步病因分类后发现，其仅在病毒性因素所致肝移植术后黄疸的肝组织中表达下降，而在肝移植术后排斥反应、缺血再灌注损伤、药物毒物及胆管阻塞等因素所致肝移植后黄疸的肝组织中的表达跟正常组比较并无统计学意义。Diao[8]、陈凯[12]等研究显示在受到LPS刺激或ANIT所致的大鼠急性肝损伤胆汁淤积模型中，大鼠肝脏上MRP2 mRNA及蛋白表达水平均逐步下降，但在48 h随着肝损伤的修复又恢复正常，提示MRP2蛋白在胆汁中胆红素的排泄及对肝脏的保护中具有重要作用。人肝组织中亦有类似发现：Gernot Zollner等[13]在炎症诱导的胆汁淤积的人肝组织中MRP2 mRNA的保持不变，柴进等[14]亦发现人阻塞性胆汁淤积下肝脏MRP2 mRNA无明显变化。故我们推测部分肝组织中MRP2表达无明显下降可能是随着胆汁淤积病程的延长机体为减少肝细胞的损伤而发生的一种适应性反应或自我保护机制。

另外，本研究显示MDR3在肝移植术后黄疸患者肝组织中的表达较正常对照组相比亦明显下降。其中，在肝移植术后排斥反应、缺血再灌注损伤、药物毒物及阻塞性因素所致黄疸患者的肝组织中MDR3的表达量较正常对照组表达明显下降，而Bernhardt等[15]在Pringle手术后对低胆红素血症组及高胆红素血症组肝组织的肝胆转运蛋白MDR3 mRNA表达的影响无统计学意义，仅略有下降，推测肝移植术后这些因素可能对肝移植术后胆汁酸盐的影响较大，导致MDR3基因表达水平下降更为持久或较难恢复，从何阻碍磷脂的转运，不能与过高的胆盐结合，胆盐游离，进而引起胆管细胞凋亡或坏死，最终导致肝移植术后黄疸的发生。但病毒性因素所致的肝移植术后黄疸者MDR3的表达较对照组差别无统计学意义。

综上，肝移植术后黄疸患者肝组织中胆汁酸外排转运蛋白BSEP、MRP2、MDR3蛋白的表达均下调，提示其可能在肝移植术后胆汁淤积的发病机制中起着重要的作用。但不同病因所致者黄疸者肝组织中转运蛋白的表达水平存在着差别，某些转运蛋白表达相对保留可能是机体为减轻胆汁盐潴留造成的肝脏损而发生的一种适应性反应。