金黄色葡萄球菌类肠毒素K对T淋巴细胞活化特点及抗肿瘤活性研究①

何亚南 孙钰椋 任雅坤 张胜辉 陈童彤 路依林 郭 睿 刘彦礼 李永海 林俊堂

（新乡医学院生命科学技术学院，新乡453003）

金黄色葡萄球菌肠毒素（Staphylococcal enterotoxins，SEs）是由金黄色葡萄球菌分泌的一类外毒素，由于其超抗原活性成为研究重点［1］。作为典型超抗原，SEs通过直接与主要组织相容性复合物Ⅱ类分子（major histocompatibility complex classⅡ，MHCⅡ）非限定性结合，无需抗原递呈细胞（antigen presenting cell，APC）加工呈递便可以完整分子形式递呈给T淋巴细胞，从而活化大量具有特异性TCR Vβ亚群的T淋巴细胞（5%～20%，包括CD4+和CD8+T细胞），随后释放大量细胞因子，如IL-2、IFN-γ及TNF-α等，同时产生强烈的细胞介导的细胞毒性作用，尤其对MHCⅡ阳性表达的肿瘤细胞具有较强杀伤作用［2-3］。因此，SEs诱导的免疫激活作用已被广泛用于抗肿瘤免疫治疗研究［4］。但SEs具有诱发机体呕吐、腹泻和发热等毒副作用，一定程度上限制了其临床应用［5］。

随着SEs研究深入，2004年国际命名委员会将SEs家族的1个亚组命名为金黄色葡萄球菌类肠毒素（Staphylococcal enterotoxin-like，SEls）［6］，其具有与典型SEs相似的结构及超抗原活性，但无致呕等副作用，在临床治疗恶性肿瘤中具有潜在应用价值，并已有相关报道［7］。目前已鉴定出一系列SEls成员，包括SElJ、SElK-Q、SElU、SElV和SElX等［8-10］。课题组前期已成功构建并表达高纯度SElK［11］。本研究旨在研究SElK对T淋巴细胞的活化作用，并分析其体内外抗肿瘤活性，为进一步阐明SElK超抗原活性提供理论基础，以期促进SElK在临床肿瘤治疗中的应用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物、细胞、外周血6～8周龄SPF级BALB∕c雌性小鼠，体重（24±2）g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK（京）2012-0001，所有动物实验均获得我院动物保护委员会批准，并按照中国动物保护协会要求进行操作；肿瘤细胞株由本实验室保存；本研究中所用外周血样本均由本实验室志愿者知情同意情况下捐赠，相关实验操作符合我院伦理委员会要求。

1.1.2 主要试剂MTT购自Sigma公司；FBS（胎牛血清）、DMEM高糖培养基和RPMI1640培养基购自Hyclone公司；超纯RNA提取试剂盒购自北京鼎国昌盛公司；5×All-In-One RT MasterMix和Prime ScriptTMRT Master Mix购自TaKaRa公司；CD4-PE和CD8-FITC购自ebioscience公司；细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒购自上海碧云天。

1.1.3 主要仪器HR40-IIA2型超净工作台（青岛海尔生物医疗股份有限公司）；L3-5K型台式低速离心机（湖南可成仪器设备有限公司）；MCO-18AC型CO2培养箱（上海普和希健康医疗器械有限公司）；FACSCalibur型流式细胞仪（BD公司）；5020型PCR仪（Thermo公司）；ABI Prism 7500型qPCR仪（Applied Biosystems公 司）；SpectraMax®i3型酶标仪（Molecular Devices公司）。

1.2 方法

1.2.1 小鼠脾淋巴细胞及人PBMCs分离提取 无菌条件下分离小鼠脾脏，研磨后获得脾细胞悬液，100 μm不锈钢筛网过滤，红细胞裂解液裂解2次，PBS洗2次，含10% FBS的RPMI1640培养基重悬，调整细胞密度至1×107个∕ml备用。抗凝管中新鲜外周血与PBS等体积稀释，常规密度梯度离心分离获得人PBMCs，加入红细胞裂解液裂解残留红细胞，洗2次，含10%FBS的RPMI1640培养基重悬PBMCs，调整细胞密度至2×106个∕ml备用。

1.2.2 流式细胞术 小鼠脾淋巴细胞（终密度5×106个∕ml）接种至6孔板，2 ml∕孔，加入SElK（终浓度1 μg∕ml）37℃、5%CO2下刺激小鼠脾淋巴细胞72 h；收集细胞，PBS洗2次，100 μl PBS重悬，分别加入CD4-PE和CD8-FITC单克隆抗体4℃避光孵育30 min，PBS洗2次，Guava easyCyte流式细胞仪检测，FlowJo软件分析。

1.2.3 qPCR将调整后的小鼠脾淋巴细胞（终密度5×106个∕ml）与SElK（终浓度1 μg∕ml）共 培 养48 h，超纯RNA提取试剂盒提取细胞总RNA，5×All-In-One RT Master Mix试剂盒反转录1 μg RNA获得cDNA，SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒及ABI Prism 7500进行qPCR反应，检测目的基因表达。小鼠源β-actin、IFN-γ、颗粒酶A（Granzyme A）和颗粒酶B（Granzyme B）特异性引物序列见表1［12-13］，2-ΔΔCt法计算，7500 Software v2.3软件分析数据。调整后的人PBMCs（终密度1×106个∕ml）与SElK（终浓度1 μg∕ml）共培养48 h，收集细胞cDNA。参考文献［14］相对定量法及特异性引物进行Vβ谱分析，采用标准曲线计算样本Vβ和Cβ的绝对拷贝数，计算各Vβ百分比=（Vβn∕Cβ）×100%。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.4 细胞凋亡检测 将小鼠脾淋巴细胞（终密度5×106个∕ml）接种到至6孔板，3 ml∕孔，加入SElK（终浓度0.1、1.0和10 μg∕ml）与小鼠脾淋巴细胞悬液37℃、5%CO2共培养48 h，收集细胞，按照Annexin V-FITC∕PI凋亡检测试剂盒说明书进行操作，流式细胞术检测细胞凋亡，实验重复3次。

1.2.5 体外抗肿瘤活性检测 人PBMCs作为效应细胞，BT474和A431细胞作为靶细胞，检测SElK的体外抗肿瘤活性。靶细胞（BT474：8×103个∕100 μl，A431：3×103个∕100 μl）依次接种于96孔板，37℃、5%CO2培养12 h后移除旧培养基，PBS洗2次，加入人PBMCs悬液（2×105个∕50 μl），加入PBS（50 μl）孔作为对照；分别加入连续稀释的SE1K（50 μl，终浓度0.1、1.0和10 μg∕ml）孔作为SElK处理组；SElK刺激的人PBMCs（终浓度0.1、1.0和10 μg∕ml）孔作为空白组；仅加入RPMI1640培养基为背景组。37℃、5%CO2培养48 h后加入20 μl MTT继续培养4 h。2 000 r∕min离心10 min，吸出液体，120 μl∕孔依次加入DMSO。将96孔板置于酶标仪中振荡20 s，设置测定波长为570 nm，参考波长为630 nm，检测各孔吸光度（A），计算肿瘤生长抑制率（%）=｛1-［（ASElK处理组-A背景组）-（A空白组-A背景组）］∕（A对照组-A背景组）｝×100%。

1.2.6 体内抗肿瘤活性检测 小鼠肿瘤模型建立：取8只小鼠，在第0天皮下注射200 μl（2×106个∕只）小鼠乳腺癌细胞（EMT-6）至小鼠右腋下，第1天将小鼠随机分成2组：实验组［SElK，尾静脉注射30 μg∕（200 μl·只）］，对照组（尾静脉注射等体积PBS），每组4只，第5、10、5、20、25天分别注射PBS或SElK。第5天开始每5 d观察肿瘤组织大小，计算肿瘤体积（mm3）=最长直径×最短直径2∕2，实验结束时（第30天）处死小鼠，分离肿瘤组织，拍照并称重。

1.3 统计学处理 采用SPSS13.0软件进行统计学分析。数据以±s表示，两组间比较采用t检验；多组间比较采用Dunnett检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SElK对T淋巴细胞亚型增殖的影响SElK（1 μg∕ml）可显著刺激小鼠脾淋巴细胞CD4+和CD8+T淋巴细胞增殖，与对照组相比，SElK刺激后可显著促进小鼠脾淋巴细胞CD4+和CD8+T淋巴细胞增殖，二者百分比分别提高1.40倍（P＜0.05）和1.25倍（P＜0.01，图1A、B）。

2.2 SElK显著刺激小鼠脾淋巴细胞中相关细胞因子表达qPCR法检测SElK体外刺激小鼠脾淋巴细胞48 h后，脾淋巴细胞中IFN-γ、颗粒酶A和B基因表达量显著升高，细胞毒性T淋巴细胞标志物颗粒酶A和B表达变化更为显著（P＜0.01，图1C）。

图1 SElK对小鼠T淋巴细胞的活化作用Fig.1 Effect of SElK on mouse derived T lymphocytes ac⁃tivation

2.3 SElK对小鼠脾淋巴细胞凋亡的影响 流式细胞术检测SElK刺激48 h后小鼠脾淋巴细胞凋亡情况，不同浓度SElK（0.1、1.0和10 μg∕ml）刺激组与未刺激组均呈现明显凋亡现象，但与未刺激组相比，不同浓度SElK处理组中淋巴细胞早期凋亡比例变化无统计学意义，晚期凋亡比例明显降低（P＜0.01），正常活细胞比例显著提高（P＜0.01，图2）。表明SElK可显著激活脾淋巴细胞并维持其活性，进而延缓细胞凋亡。

图2 流式细胞术检测SElK刺激小鼠脾淋巴细胞48 h后细胞凋亡情况Fig.2 Apoptosis of splenic lymphocytes stimulated by SElK for 48 h were analyzed by flow cytometry

2.4 SElK体外刺激人T淋巴细胞中Vβ的表达谱 根据目前已建立的qPCR法检测SElK体外刺激人PBMCs特异性Vβ T淋巴细胞的增殖谱，结果显示，与对照组相比，SElK可激活携带TCR Vβ5（P＜0.01）、TCR Vβ17（P＜0.05）和TCR Vβ20（P＜0.05）亚群的T淋巴细胞，携带TCR Vβ5的T淋巴细胞最为显著（图3）。

图3 SElK激活人PBMCs特异性TCR Vβ谱Fig.3 SELK activates TCR Vβ spectrum specific to hu⁃man PBMCs

2.5 SElK体外显著抑制肿瘤生长 采用MTT法检测SElK对BT474和A431肿瘤细胞生长的抑制作用，结果显示，与阴性对照组相比，SElK在体外刺激人PBMCs后对肿瘤细胞BT474及A431的杀伤作用较强，在体外具有显著抗肿瘤活性（P＜0.01），肿瘤细胞生长抑制率为90%以上（图4A）。

2.6 SElK体内显著抑制肿瘤生长 为进一步检测SElK的体内抑瘤活性，实验周期内实时检测肿瘤体积，结果表明自15 d起，各检测时间节点SElK对小鼠肿瘤生长具有明显抑制作用（图4B，P＜0.01）。实验周期结束时，分离小鼠肿瘤组织，可明显观察到SElK（30 μg∕只）处理组小鼠肿瘤组织较PBS对照组小鼠肿瘤组织缩小（图4C）；重量检测结果表明SElK（30 μg∕只）处理组小鼠体内肿瘤组织重量较PBS对照组小鼠肿瘤组织重量显著降低（图4D，P＜0.01）。

图4 SElK体内外抗肿瘤活性检测Fig.4 Antitumour effect of SElK in vitro and in vivo

3 讨论

肿瘤严重威胁人类健康，尽管可通过手术、放化疗等手段治疗，但依然存在复发及转移风险，现有抗肿瘤药物不仅对肿瘤细胞具有杀伤作用，同时也会影响正常细胞功能和存活，具有严重副作用。传统肿瘤治疗方法的局限性促使研究者寻找新的替代疗法，而通过免疫增强剂激活宿主自身免疫力具有广阔前景。肿瘤免疫治疗是利用自身免疫系统对恶性肿瘤细胞进行特异性杀伤，并尽可能地降低副作用，是继化疗和靶向治疗后最具前景的肿瘤治疗方法之一［15］。

SEs作为典型的细菌外毒素，早在1989年就已将该类能够诱导极强免疫学活性的蛋白命名为超抗原［16］。而作为超抗原家族成员，SEs通过与MHCⅡ类分子和特定TCR Vβ链可变区结合，有效激活具有特异性TCR Vβ片段的T淋巴细胞，发挥潜在高效的抗肿瘤作用［17］。已有大量报道证实SEs具有较强的肿瘤治疗潜力，并在基础及临床研究中证实SEs治疗后可产生较强的抗肿瘤作用［18］。我国SEA、SEB和SEC2已被用作肿瘤治疗的补充药物成分。作为经典的超抗原，SEA可有效抑制黑色素瘤生长［19］；SEB在体外和体内都能激活T淋巴细胞抑制膀胱肿瘤细胞生长或将其直接杀灭［20］；SEC2一直被用作肿瘤治疗的辅助药物［21］。尽管SEs在肿瘤治疗领域展现出较强的潜能，但其自身固有的肠毒性及致呕毒性产生严重副作用，限制了其作为新型抗肿瘤制剂的应用，而致呕吐毒性较低的SEls的发现为开发新型抗肿瘤制剂提供了候选药物［22］。

因此，本研究重点分析SElK对T淋巴细胞的活化效果，并验证其体内外抗肿瘤活性，进一步阐明SElK的超抗原特性，结果显示，SElK刺激后小鼠脾淋巴细胞中CD4+T和CD8+T淋巴细胞百分比显著上调，尤其是CD4+T淋巴细胞。作为辅助性T淋巴细胞，CD4+T淋巴细胞可引导免疫系统对肿瘤细胞的攻击；而CD8+T淋巴细胞是诱导肿瘤细胞和病毒感染细胞死亡的细胞毒性T淋巴细胞的主要参与者，可直接杀灭肿瘤细胞［23］。qPCR检测结果发现，SElK可显著刺激人PBMCs中携带TCR Vβ5、17和20亚群的T淋巴细胞增殖。同时SEs激活的T淋巴细胞可分泌大量细胞因子，对肿瘤细胞杀伤至关重要［24］。本研究结果亦表明，SElK激活的小鼠脾淋巴细胞中，IFN-γ、颗粒酶A和B基因表达显著增加，尤其是颗粒酶A和B基因表达呈剂量依赖性增加，与CD8+T淋巴细胞上调结果一致，表明SElK刺激后显著增强细胞毒性T淋巴细胞活性。细胞凋亡实验结果发现，与对照组相比，不同浓度SElK处理组中，尽管对淋巴细胞的早期凋亡无明显影响，但可显著降低晚期凋亡细胞比例，且活细胞比例显著增加，表明SElK在淋巴细胞凋亡过程中可维持细胞活性进而减少淋巴细胞凋亡。体外实验结果表明，SElK可通过促进T淋巴细胞活化和细胞因子释放发挥其潜在抗肿瘤活性，因此，SElK激活的人PBMCs在体外对人肿瘤细胞BT474和A431生长具有强烈抑制作用，抑制率达90%以上。体内实验结果表明，SElK在免疫系统正常的小鼠肿瘤模型中发挥较强的抗肿瘤作用，SElK治疗后可显著抑制肿瘤生长。但SElK治疗后尚未完全杀死肿瘤细胞，小鼠体内肿瘤仍在继续生长，表明临床上SElK与放化疗联用可能抗肿瘤效果更佳。

综上，本研究表明，SElK可显著促进T淋巴细胞活化，并释放大量细胞因子，最终诱导其体内外较强的抗肿瘤活性，丰富了对SElK超抗原特性的认识，同时也为其在临床肿瘤免疫治疗中的应用提供理论依据。