DHRS2抑制肝细胞肝癌增殖和转移的功能研究①

马 轶 滕 颖 刘 慧 毕 爽（沈阳市第六人民医院介入科，沈阳110006）

肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，其发病率在全球排名第六，死亡率排名第四，每年约有84万例新发病例和78万例死亡病例，其死亡率仅低于发病率［1］。肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是最常见的原发性肝癌类型，占肝癌的90%以上。尽管HCC的治疗有所改善，但由于其疾病诊断时常处于晚期，导致治疗具有较大局限性，HCC患者的预后和生存率仍然令人沮丧［2］。因此更彻底地了解HCC的发病分子机制，并找到更有效的治疗策略至关重要。脱氢酶∕还原酶SDR家族成员2（dehydrogenase∕reductase SDR family member 2，DHRS2）也称HEP27，最初由GABRIELLI等［3］专家从HepG2细胞系中克隆而来，并发现组蛋白脱乙酰基酶抑制剂丁酸钠处理HepG2细胞后，DHRS2在细胞核中积累，并诱导细胞停滞在G1期。同时有研究表明，DHRS2在结直肠癌、鼻咽癌和卵巢癌等多种肿瘤中表达异常，其表达水平与肿瘤增殖、转移和耐药等恶性生物学行为密切相关［4-6］。但DHRS2在HCC中发挥的具体作用目前还未见报道，因此本文对此进行研究，并发现DHRS2抑制HCC细胞的增殖和转移能力，可能是HCC新的治疗靶点。

1 材料与方法

1.1 材料HCC细胞系Huh-7、HepG2和SK-hep-1及正常肝细胞系LO2购自中国科学院；DMEM高糖培养基和FBS购于美国Hyclone公司；DHRS2过表达质粒购于上海吉凯基因公司；CCK8试剂购自美国GlpBio公司；6孔板、96孔板和Transwell小室购自美国BD公司；细胞周期检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；蛋白裂解液和BCA蛋白浓度检测试剂盒购自中国北京索莱宝试剂公司；Toll样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）和人髓性分化原发反应蛋白88（myeloid differentiation primary response 88，MyD88）抗体购自英国Abcam公司；ECL化学发光试剂盒购于美国Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 生物信息学分析 于http：∕∕ualcan.path.uab.edu∕index.html网站页面中选择“HCC”，并输入“DHRS2”基因进行分析，得出TCGA数据库中HCC组织和正常肝组织中DHRS2的表达水平。于http：∕∕kmplot.com∕analysis∕index.php？p=service网站页面中肿瘤类型选择“HCC”，并输入“DHRS2”基因，点击总生存期分析，得出kaplan meier plotter数据库中DHRS2的表达对HCC患者预后的影响。

1.2.2 细胞培养及过表达质粒转染HCC细胞系Huh-7、HepG2和SK-hep-1及正常肝细胞系LO2复苏后重悬至含10%FBS的DMEM高糖培养基，置于37℃、5%CO2全湿培养箱中培养。将呈对数生长的Huh-7细胞以2×105个∕孔接种于6孔板，分为对照组（NC组）和DHRS2过表达质粒转染组（oe-DHRS2组），铺板12 h，采用脂质体2000将质粒分别转染至各组Huh-7细胞，12 h后更换新鲜培养基继续培养。

1.2.3 CCK8实验 取生长状态良好的Huh-7细胞以1 500个∕孔铺至96孔板，分为NC组和oe-DHRS2组，每组设置6个复孔，按上述过表达质粒转染方法转染。分别在细胞转染后的第24 h、48 h、72 h和96 h，加入CCK8试剂，继续孵育2 h后，酶标仪检测各孔在波长450 nm处的吸光度（OD）值。

1.2.4 平板克隆实验 取生长状态良好的Huh-7细胞，以500个∕孔铺至6孔板，分为NC组和oe-DHRS2组，每组设置3个复孔，按上述过表达质粒转染方法转染。细胞在培养箱中培养2周左右时，形成肉眼可见的克隆团。PBS洗去培养基后，加入甲醇固定，吉姆萨染色，干燥扫描后计数克隆团。

1.2.5 细胞周期实验 取上述转染NC和oe-DHRS2 48 h的Huh-7细胞，加入预冷的无水乙醇固定过夜，PBS洗3次后，按照细胞周期检测试剂盒染色，流式细胞仪分析各组细胞周期比例。

1.2.6 Transwell实验 取上述转染NC和oe-DHRS2 48 h的Huh-7细胞，无血清培养基洗3次后，取1×105个细胞加入Transwell小室，下室加入500 μl完全培养基。培养24 h后，PBS洗去Transwell小室上室面细胞，甲醇固定下室面细胞，吉姆萨染色，显微镜下拍照，计数穿膜细胞数。

1.2.7 Western blot取上述转染NC和oe-DHRS2 48 h的Huh-7细胞，PBS洗3次后，加入蛋白裂解液，超声仪裂解破碎细胞，14 000 r∕min、4℃离心30 min。获取上清液，并检测蛋白浓度。采用10% SDSPAGE 80 V电泳分离蛋白，350 mA湿转至PVDF膜，5%BSA室温孵育PVDF膜1 h，TLR4和MyD88一抗4℃孵育过夜，二抗室温孵育1 h，ECL试剂曝光条带。Image J软件测定蛋白条带灰度值。

1.3 统计学分析 采用SPSS21.0软件进行统计学分析。数据以±s表示，t检验统计两组间差异，单因素方差统计多组间的差异。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DHRS2在HCC组织中的表达水平TCGA数据库分析DHRS2在HCC组织中的表达水平，分析结果显示DHRS2 mRNA在371例HCC组织中的表达低于在50例正常肝组织中的表达水平（P＜0.05），见图1。

图1 TCGA数据库分析DHRS2在HCC组织中表达减少Fig.1 TCGA database analysis of reduced expression of DHRS2 in HCC tissues

2.2 DHRS2对HCC患者预后的影响Kaplan meier plotter数据库分析DHRS2的表达对HCC患者预后的影响。结果显示1 307例低表达DHRS2的HCC患者较3 792例高表达DHRS2的HCC患者的预后差，见图2。

图2 Kaplan-meier plotter数据库分析低表达DHRS2的HCC患者预后差Fig.2 Kaplan-meier plotter database analyzed poor prog⁃nosis of HCC patients with low expression of DHRS2

2.3 DHRS2在HCC细胞系中的表达水平Western blot检测DHRS2在HCC细胞系Huh-7、HepG2和SK-hep-1及正常肝细胞系LO2中的表达水平，结果显示，DHRS2在HCC细胞中的表达均低于在正常肝细胞系LO2中的表达，在Huh-7细胞中的表达最低（P＜0.05），见图3A。选择Huh-7进行DHRS2过表达质粒转染，用于后续实验。Western blot结果显示，DHRS2在oe-DHRS2组细胞中的表达高于在NC组细胞中的表达，DHRS2过表达质粒可显著增加Huh-7细胞中DHRS2的表达（P＜0.05），见图3B。

图3 DHRS2在各细胞系中的表达Fig.3 Expressions of DHRS2 in each cell lines

2.4 CCK8检测细胞增殖能力DHRS2过表达质粒转染HCC细胞Huh-7后，与NC组相比，oe-DHRS2组细胞增殖能力降低（P＜0.05），见图4。

图4 CCK8实验检测DHRS2抑制HCC细胞增殖能力Fig.4 CCK8 assay detected ability of DHRS2 to inhibit proliferation of HCC cells

2.5 平板克隆实验检测细胞克隆形成能力DHRS2过表达质粒转染HCC细胞Huh-7后，NC组细胞克隆团数目为（54.65±10.15）%，oe-DHRS2组细胞克隆团数目为（18.42±3.51）%。与NC组相比，oe-DHRS2组细胞克隆形成能力降低（P＜0.05），见图5。

2.6 流式细胞术检测细胞周期DHRS2过表达质粒转染HCC细胞Huh-7后，NC组G2∕M期细胞比率为（13.52±3.58）%，oe-DHRS2组G2∕M期细胞比率为（28.68±7.58）%。与NC组相比，oe-DHRS2组G2∕M期细胞比率增加（P＜0.05），见图6。

图6 细胞周期实验检测DHRS2诱导HCC细胞阻滞在G2/M期Fig.6 Cell cycle assay detected DHRS2 induction of HCC cell arrest in G2/M phase

2.7 Transwell实验检测细胞转移能力DHRS2过表达质粒转染HCC细胞Huh-7后，NC组细胞穿膜数目为（70.67±3.79）%，oe-DHRS2组细胞穿膜数目为（32.67±3.78）%。与NC组相比，oe-DHRS2组细胞转移能力降低（P＜0.05），见图7。

图7 Transwell实验检测DHRS2抑制HCC细胞转移能力Fig.7 Transwell assay detected ability of DHRS2 to inhibit HCC cell metastasis

2.8 Western blot检 测TLR4∕MyD88信 号 通 路 活性DHRS2过表达质粒转染HCC细胞Huh-7后，与NC组相比，oe-DHRS2组细胞TLR4和MyD88蛋白表达降低（P＜0.05），见图8。

图8 Western blot检测DHRS2抑 制TLR4和MyD88蛋白的表达Fig.8 Western blot detected DHRS2 inhibit expressions of TLR4 and MyD88 proteins

3 讨论

HCC是消化系统恶性肿瘤之一，其在亚洲发病尤为普遍，约有一半的HCC新发患者来自中国［1］。HCC的主要危险因素是乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒感染，以及黄曲霉毒素暴露和重度饮酒等，我国乙肝患病率较高，HCC发病率具有增高趋势［7］。目前HCC的治疗主要包括手术切除、放化疗和靶向治疗，其中肿瘤切除和肝脏移植是早期肝癌的主要治疗策略，但近40%的患者在肝切除术后的第一年内复发，且肝脏移植来源困难［8］。晚期肝癌的治疗主要取决于经导管动脉化疗栓塞、放疗、化学疗法和索拉非尼的靶向治疗，肿瘤细胞对于放化疗及靶向药物的抵抗性，仍然是不可攻克的难题［9］。HCC的高度侵袭性和治疗方法的局限性促使HCC长期预后仍然不能令人满意［2］。可行且有效的治疗方法是HCC的研究重点。目前HCC的发病机制尚未完全明确。因此探索HCC进展的详细机制有助于确定HCC新的治疗靶点。

短链醇脱氢酶∕还原酶（SDR）超家族参与多种中间代谢过程和脂质信号分子代谢，结构中含有一些常见的序列基序，如NAD∕NADP辅因子结合结构域的甘氨酸共有序列，作为催化结构域的氨基酸和分布在序列之间高度保守的氨基酸序列，这些结构使SDR酶在生理和病理过程中发挥重要功能［10］。SDR酶超家族的成员SDR25C1，又称DHRS2，位于染色体14q11.2，该区域在许多肿瘤中具有高频杂合性缺失，在肿瘤的发生和恶性进展中发挥重要功能［11］。DHRS2在奥沙利铂耐药的结直肠癌细胞HCT116中表达增加，而沉默DHRS2的表达可通过p53依赖性途径有效地恢复奥沙利铂的敏感性，抑制DHRS2的表达可能是预防结直肠癌奥沙利铂耐药的有效策略［4］。鼻咽癌中DHRS2在体内和体外抑制肿瘤细胞的生长，并可作为抗肿瘤药物天花霉素的靶点治疗鼻咽癌［5］。由此可见，DHRS2在不同类型肿瘤中发挥的作用可能不一致，而DHRS2在HCC中的具体作用未知。本文采用TCGA和Kaplan meier plotter两大数据库分析得出，DHRS2在HCC中表达下调，且DHRS2表达高的HCC患者具有较好的预后。与HAN等［6］报道的卵巢癌组织中DHRS2表达降低，卵巢癌患者中DHRS2的高表达与更好的预后相关结果一致。本文由于条件的限制，未在组织样本上进行分析，但在细胞水平上检测了DHRS2的表达，Western blot结果显示DHRS2蛋白在HCC细胞系中的表达均低于在正常肝细胞系LO2中的表达，提示DHRS2在HCC中可能发挥抑癌基因作用。

进一步选择HCC表达低的Huh-7细胞进行DHRS2过表达质粒转染，研究其在HCC中发挥的具体生物学功能。ZHOU等［11］报道DHRS2表达的下调与食管癌的侵袭、淋巴结转移、临床分期晚期和患者预后较差有关，且体外和体内功能实验研究均表明，DHRS2可抑制食管癌细胞增殖和细胞转移能力。本文功能实验结果显示，过表达DHRS2抑制HCC细胞的增殖活性、平板克隆形成和转移能力，并使细胞阻滞在G2∕M期，其中细胞增殖活性、平板克隆形成能力和细胞周期均反映细胞的增殖能力，表明DHRS2在HCC中与细胞增殖和转移恶性行为有关。Toll样受体家族是重要的受体家族，在肿瘤免疫抑制中发挥重要功能，其家族成员TLR4介导的炎症在宿主防御入侵病原体和对炎症刺激的生理反应中都至关重要，TLR4在慢性肝炎和肝硬化中增加，在HCC中维持高表达［12-14］。而MyD88是TLR4发挥作用的关键衔接分子，也是肿瘤发生过程中的关键分子，其调控的下游分子参与肿瘤的增殖和转移，在HCC中MyD88呈高表达状态，TLR4∕MyD88信号通路是促进肿瘤发生发展的重要相关途径［15-17］。本研究发现DHRS2抑制HCC细胞中TLR4和MyD88蛋白表达，表明DHRS2可能通过降低TLR4∕MyD88信号通路活性抑制HCC细胞增殖和转移能力。

综上所述，DHRS2在HCC中发挥抑癌基因功能，其可能通过调控TLR4∕MyD88信号通路活性抑制HCC细胞增殖和转移能力，DHRS2可能是治疗HCC的新型有效治疗靶标。