SPACE肽修饰成纤维细胞生长因子21的制备及对小鼠皮肤瘢痕形成的抑制作用

曾 静 熊 庆 张丽丽 袁 娟 何 莹 邱黎菲（都江堰市人民医院医疗美容科，都江堰611830）

成纤维细胞生长因子21（fibroblast growth factor 21，FGF21）属于FGF基因家族，主要分布于肝脏、胰腺、脂肪等组织，在糖脂代谢、胰岛素抵抗、胚胎发育等过程中发挥重要作用［1-3］。近年来，FGF21的抗纤维化作用在肾脏、胰腺、心脏等器官中得到证实，但是其是否能够缓解皮肤瘢痕的纤维增生尚未见报道［4-7］。

皮肤角质层是大分子蛋白的天然屏障，而且皮肤瘢痕中高度增厚的真皮也是FGF21难以有效发挥作用的障碍［8］。SPACE（skin penetrating and cell entering）肽作为一种皮肤穿透肽，已成功用于小干扰RNA、链霉亲和素、透明质酸等物质的皮肤递送，在载药透皮中具有广阔的应用价值［9-10］。

本实验在FGF21的下游引入SPACE编码序列，构建pET-28a-FGF21-SPACE质粒，使用大肠杆菌表达系统获得FGF21-SPACE重组蛋白，并制备相应的卡波姆凝胶制剂。随后建立博来霉素诱导小鼠皮肤瘢痕模型，考察该模型下FGF21-SPACE的透皮能力及对皮肤形态结构、血管生成、纤维化因子表达的影响，从动物模型的角度初步验证FGF21-SPACE对皮肤瘢痕形成的抑制作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物SPF级健康雌性的C57BL∕6小鼠，7～8周龄，体重（23±3）g，购自上海斯莱克实验动物有限公司。饲养温度：（25±2）℃，相对湿度：50%～60%，分笼饲养，自然光照射，自由饮食和进水，饲养1周适应新环境后再进行实验。

1.1.2 主要试剂和仪器IPTG、博来霉素购自美国Sigma公司；Ni-agarose亲和层析柱购自美国GE公司；抗FGF21抗体购自美国Santa Cruz公司；其余一抗抗体购自英国Abcam公司；二抗购自武汉三鹰生物技术有限公司；卡波姆980购自青岛天力源生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 质粒的构建 根据小鼠FGF21的成熟蛋白质序列（NCBI序列号：NP_064397.1），结合大肠杆菌密码子偏好性，设计对应的核苷酸序列。在FGF21的上游引入NdeⅠ酶切位点，在FGF21的下游引入SPACE与XhoⅠ酶切位点，该序列即为FGF21-SPACE编码序列，将其插入至pET-28a质粒，送上海生工生物工程股份有限公司合成pET-28a-FGF21-SPACE质粒。合成pET-28a-FGF21对照质粒，即无SPACE编码序列外，其余序列同FGF21-SPACE。

1.2.2 蛋白的表达与鉴定 将测序正确的pET-28a-FGF21与pET-28a-FGF21-SPACE质 粒 转化至BL21细菌中，常规培养后，使用IPTG诱导表达，收集菌体、超声破碎等步骤后收集含重组蛋白的上清。使用Ni-agarose亲和层析柱纯化，冷冻干燥后获得重组蛋白。使用SDS-PAGE检测FGF21与FGF21-SPACE的分子量，并使用Western blot鉴定，抗FGF21抗体的孵育浓度为1：2 000。

1.2.3 凝胶的制备 参照祁万强等［11］的研究制备凝胶，具体步骤为：将0.6 g卡波姆980加入至30 ml蒸馏水中，静置12 h。使用500 μl的蒸馏水溶解1 μg重组蛋白质，然后加至卡波姆絮状液中，混合均匀。缓慢滴加三乙醇胺溶液将pH值调节至7.4～7.5，离心去除气泡，放置4℃冰箱待用。

1.2.4 免疫组织化学染色检测透皮能力 根据文献［12］报道对C57BL∕6小鼠进行皮肤瘢痕造模，具体步骤为：在1 cm×1 cm的区域皮下注射100 μl的博来霉素（1 mg∕ml），每日1次，连续注射21 d。博来霉素诱导后次日，在诱导区域分别涂抹空白凝胶、FGF21凝胶与FGF21-SPACE凝胶，然后用无菌纱布及胶带固定。48 h后取该处皮肤组织，常规制备石蜡切片，免疫组织化学染色检测重组蛋白氨基端携带的His标签，抗His抗体的孵育浓度为1：100。

1.2.5 动物实验分组与处理 将40只C57BL∕6小鼠随机分为4组，即对照组、模型组、FGF21组、FGF21-SPACE组，每组10只。除对照组皮下注射相同体积的生理盐水，其余3组均进行皮肤瘢痕造模。博来霉素诱导后次日，FGF21组在博来霉素诱导区域涂抹含FGF21重组蛋白质的凝胶；FGF21-SPACE组涂抹含FGF21-SPACE重组蛋白质的凝胶；对照组和模型组涂抹空白凝胶作为对照。凝胶涂抹完用无菌纱布及胶带固定。每2 d涂抹1次，共30 d。

1.2.6 HE与Masson染色检测形态学变化 取皮肤样本，常规制备石蜡切片，厚度为5 μm，常规行HE与Masson染色，使用光学显微镜观察和拍照。

1.2.7 免疫荧光染色检测CD31、TGF-β1表达 常规制备皮肤组织冰冻切片，免疫荧光染色检测CD31（1：200）、TGF-β1（1：100）表达，CD31的检测使用Cy3标记的二抗，TGF-β1的检测使用FITC标记的二抗。

1.2.8 Western blot检测α-SMA、纤连蛋白、胶原蛋白Ⅰ的表达皮肤组织匀浆后，取样本进行SDSPAGE电泳与电转膜，分别使用抗α-SMA抗体（1：1 000）、抗纤连蛋白抗体（1：1 000）、抗胶原蛋白Ⅰ抗体（1：2 000）、抗GAPDH抗体（1：3 000）4℃过夜孵育。次日，二抗孵育后显色及拍照。

1.3 统计学分析 使用SPSS21.0软件进行统计学分析。所有计量数据均符合正态分布，表示为±s，多组间的比较使用单因素方差分析，组间两两比较使用LSD-t检验。以α=0.05为检验水准。

2 结果

2.1 FGF21-SPACE重组蛋白的表达与鉴定FGF21与FGF21-SPACE的理论分子量分别为25.54 kD与26.61 kD，与SDS-PAGE电泳图的条带相一致，见图1A。Western blot结果显示，两重组蛋白均可与抗FGF21抗体特异性结合，见图1B。

图1 SDS-PAGE与Western blot检测FGF21-SPACE重组蛋白的表达Fig.1 SDS-PAGE and Western blot were used to detect expression of recombinant FGF21-SPACE

2.2 FGF21-SPACE重组蛋白透皮能力的检测 对His标签进行免疫组织化学染色，结果显示FGF21-SPACE凝胶的His染色强度明显强于FGF21凝胶，而空白凝胶则为阴性染色，见图2。

图2 免疫组织化学染色检测皮肤组织中His的表达与分布（×100）Fig.2 Immunohistochemical staining was used to detect ex⁃pression and distribution of His in skin tissue（×100）

2.3 FGF21-SPACE重组蛋白抑制真皮增厚和纤维化 对皮肤组织进行HE与Masson染色，结果显示与对照组相比，模型组的真皮明显增厚，纤维化程度升高，而FGF21组与FGF21-SPACE组则抑制该效应，且FGF21-SPACE组效果更好，见图3。

图3 HE与Masson染色检测皮肤组织的形态学变化Fig.3 HE and Masson staining was used to detect mor⁃phological changes of skin tissue

2.4 FGF21-SPACE重组蛋白促进血管内皮生成 对CD31的表达进行免疫荧光染色，结果显示对照组、FGF21组、FGF21-SPACE组的CD31染色强度均明显高于模型组，且FGF21-SPACE组的CD31染色强度高于FGF21组，见图4。

图4 免疫荧光染色检测皮肤组织中CD31的表达Fig.4 Immunofluorescence staining was used to detect ex⁃pression of CD31 in skin tissue

2.5 FGF21-SPACE重组蛋白下调TGF-β1表达 对TGF-β1的表达进行免疫荧光染色，结果显示对照组、FGF21组、FGF21-SPACE组的TGF-β1染色强度均明显低于模型组，且FGF21-SPACE组的TGF-β1染色强度低于FGF21组，见图5。

图5 免疫荧光染色检测皮肤组织中TGF-β1的表达Fig.5 Immunofluorescence staining was used to detect ex⁃pression of TGF-β1 in skin tissue

2.6 FGF21-SPACE重组蛋白下调α-SMA、纤连蛋白、胶原蛋白Ⅰ的表达Western blot结果显示对照组、FGF21组、FGF21-SPACE组的α-SMA、纤连蛋白、胶原蛋白Ⅰ表达量均明显低于模型组，且FGF21-SPACE组的α-SMA、纤连蛋白、胶原蛋白Ⅰ表达量低于FGF21组，差异具有统计学意义（P＜0.05），见图6和表1。

表1 皮肤组织中α-SMA、纤连蛋白、胶原蛋白Ⅰ表达的比较Tab.1 Comparison of α-SMA，fibronectin and collagenⅠexpression in skin tissue

图6 Western blot检测皮肤组织中α-SMA、纤连蛋白、胶原蛋白Ⅰ的表达Fig.6 Western blot was used to detect expression of α-SMA，fibronectin，collagenⅠin skin tissue

3 讨论

FGF21最初由NISHIMURA等［13］从小鼠的胚胎组织中分离得到，小鼠成熟的FGF21蛋白由210个氨基酸组成，人FGF21蛋白含209个氨基酸，两者具有约75%的同源性。FGF21因具有降糖、降脂、改善胰岛素抵抗等生理作用，而广泛应用于肥胖、2型糖尿、非酒精性脂肪肝等代谢性疾病［14-15］。近年研究发现，FGF21还具有较好的抗纤维化作用，如周淼等人在博来霉素诱导的肺纤维化小鼠模型中发现，FGF21可以通过激活Nrf2信号通路，抑制炎症与氧化应激反应，进而降低细胞外基质的分泌，缓解肺纤维化进程［16］。但是，FGF21是否能够缓解以纤维化为主要病理特征的皮肤瘢痕形成尚无相关报道。

皮肤角质层主要由10～20层扁平的角质层细胞组成，其间由弯曲的细胞间脂质填充，形成一种“砖墙”结构，以保护皮下组织免受微生物、物理、化学等刺激的伤害，防止水分丢失，但是该结构也是大分子物质的天然屏障，是提高皮肤给药效率面临的关键问题。随着噬菌体展示等技术的发展，各种皮肤穿透肽逐渐被发现与应用，其透皮能力已在胰岛素、小干扰RNA等物质的递送中得到证实［17-19］。SPACE肽是由HSU等［9］通过噬菌体展示技术筛选得到的兼具透皮和穿膜的新型透皮多肽，可通过巨细胞胞饮的方式穿透角阮细胞、成纤维细胞等各种细胞类型，皮肤表面应用2 h后即可在真皮深处检测到其分布情况。例如，CHEN等［10］使用磷脂制备的醇质体包裹大分子物质透明质酸（分子质量为200～325 kD），然后表面与SPACE肽共价连接，对于小鼠皮肤，该载药系统的透皮能力较对照增强5倍左右。因此，本研究拟采用SPACE肽促进FGF21透皮，以增强其抗纤维化作用。

为了最大限度减少重组蛋白溶液的蒸发，保证其持续透皮，本研究以对组织及细胞无损害作用的卡波姆凝胶作为赋形剂，制备了相应的卡波姆凝胶制剂。此外，凝胶可提供湿润、稳定的微环境，有利于维持蛋白的生物活性。卡波姆溶液呈酸性，而人体血液及组织液的正常pH值为7.35～7.45，为了使凝胶制剂更适合机体微环境，使用三乙醇胺溶液将其调节至微碱性［11］。为了进一步验证其透皮能力，对重组蛋白携带的His标签进行免疫组织化学染色，结果表明SPACE肽能够有效促进FGF21穿透表皮，进入真皮深层。

博来霉素是一种致纤维化药物，广泛应用于动物的纤维化造模，本研究则通过皮下注射博来霉素诱导小鼠皮肤瘢痕模型。HE与Masson染色结果提示FGF21具有抗纤维化效应，而且SPACE肽可以增强该效应。在缺氧环境下，受损的内皮细胞通常会代偿性增生以促进血管恢复，但是该过程在严重的瘢痕形成中受到抑制，并表现为血管缺乏［20］。CD31是内皮细胞的特异性标志物，本研究对CD31表达进行了免疫荧光染色，结果提示FGF21-SPACE可以促进血管生成，恢复氧供。在本研究中，我们观察到博来霉素可以诱导TGF-β1水平明显升高，这与其他报道一致，认为TGF-β1可通过减少抗氧化剂的合成并促进活性氧的产生，从而增加氧化应激，是纤维化形成的关键因子［21］。研究发现，在四氯化碳诱导的肝纤维化模型中，FGF21可以抑制TGF-β1表达，与本研究结果相一致，而且FGF21-SPACE对TGF-β1表达的抑制效应优于FGF21［22］。在纤维化过程中，成纤维细胞可向成肌纤维细胞分化，α-SMA则是其表达的一种特征性收缩性蛋白，并且向细胞外分泌纤连蛋白与胶原蛋白。Western blot结果表明FGF21-SPACE重组蛋白可以降低纤维化相关因子的表达，与上述抗纤维化效应相印证。

综上所述，FGF21-SPACE重组蛋白具备较好的透皮能力，可以抑制皮肤瘢痕形成，促进血管生成，降低纤维化相关因子的表达，具有较好的应用前景。