萝卜硫素对子宫内膜异位症模型大鼠在位内膜增殖、血管生成及JAK2∕STAT3信号通路的影响①

卢建军 戴晓怡 李 响 丁 阳 张 微（内蒙古医科大学附属医院妇产科，呼和浩特010059）

子宫内膜异位症（eutopic endometrium，EMT）为一种常见的妇科疾病，在育龄期女性中发病率比较高，且有逐年上升的趋势；大部分EMT患者有痛经和不孕，对女性的身体健康造成严重危害。越来越多的研究发现EMT的在位内膜和非EMT的正常子宫内膜在分子生物学特征和组织学上有显著不同，这些功能异常的EMT在位内膜具有更强的腹腔种植潜能，在EMT的发病中发挥重要作用［1］。萝卜硫素（sulforaphane，SFN）为一种比较有前景的化合物，在恶性肿瘤的防治中具有重要价值，SFN具有调节炎症反应、影响细胞增殖和凋亡、影响血管生成等方面具有重要作用，故对多种疾病具有治疗作用［2-3］。SFN在EMT中作用也引起大家关注，王静等［4］研究发现，SFN可抑制EMT大鼠的病灶体积和黏连评分，对大鼠EM具有保护作用。但SFN对EMT在位内膜的影响尚不十分清楚。本文研究SFN对EMT模型大鼠在位内膜增殖、血管生成及JAK2∕STAT3信号通路的影响，探讨SFN对ENT大鼠在位内膜的影响及可能机制进行探讨。

1 材料与方法

1.1 材料 实验动物：清洁级雌性SD大鼠，8～9周龄，体重230～250 g，购自北京市医疗器械检验所，许可证号：SYXK（京）2015-0005。主要试剂和仪器：胡萝卜素（美国Sigma公司）；兔抗鼠增殖细胞核抗原（PCNA）单克隆抗体、兔抗鼠CD34单克隆抗体、兔抗鼠细胞周期蛋白D1（cyclin D1）单克隆抗体、兔抗鼠血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）单克隆抗体、兔抗鼠JAK2单克隆抗体、兔抗鼠磷酸化JAK2（p-JAK2）单克隆抗体、兔抗鼠STAT3单克隆抗体、兔抗鼠p-STAT3单克隆抗体（美国BD公司）；DAB显色试剂盒（美国Santa Cruz公司）；倒置相差显微镜（美国Beckman Coulter公司）等。

1.2 方法

1.2.1 建立EMT模型及分组 将75只大鼠适应性喂养1周后，每天进行阴道涂片检查以了解大鼠的月经周期，取动情周期4～5 d、有连续2个正常动情周期的大鼠70只，随机取12只作为对照组（C组），其余58只在动情期建立EMT模型，具体方法［5］：造模前24 h给予戊酸雌二醇（0.2 mg∕只）灌胃，建模时采用腹腔注射3%戊巴比妥钠麻醉大鼠，刮除腹部毛发，暴露腹腔，从子宫肌层获取子宫内膜组织，将其剪成5 mm×5 mm碎片，移植到大鼠腹壁内表面，每只大鼠移植3块子宫内膜组织碎片。术后连续3 d给予青霉素钠腹腔注射预防感染，术后10 d开始进行戊酸雌二醇（0.2 mg∕只）灌胃，连续5 d。造模后第4周，选择动情期大鼠剖腹检查，见移植子宫内膜体积增大，呈囊状或透明结节状，内有液体聚集，表面有血管形成和结缔组织覆盖为造模成功。共造模成功49只大鼠，取其中48只，根据随机数字法分为模型组（M组）、SFN 5 mg∕kg、10 mg∕kg和15 mg∕kg组，每组12只。C组大鼠只开腹不移植。

1.2.2 处理 建模成功后，SFN 5 mg∕kg、10 mg∕kg和15 mg∕kg组大鼠每日清晨分别给予5 mg∕kg、10 mg∕kg、15 mg∕kg生理盐水稀释的SFN灌胃［4］；C组和M组大鼠每日清晨给予等量生理盐水灌胃，共3周。

1.2.3 标本采集 末次给药24 h后，戊巴比妥钠麻醉大鼠，开腹，剪下移植物和子宫，放入甲醛中固定。剥离子宫内膜，将子宫内膜组织分为2部分，一部分经脱水、透明、石蜡包埋，切成4 μm厚切片，用于免疫组化染色；另一部分子宫内膜组织用于Western blot测定。

1.2.4 移植物重量和体积测定 分离移植物，天平称取移植物重量；游标卡尺测量移植物长、宽和高，计算移植物体积（体积=0.52×长×宽×高）。

1.2.5 免疫组化染色测定在位内膜组织中胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）表达 将石蜡切片进行脱蜡、水化，过氧化氢室温孵育10 min，山羊血清封闭30 min，加入一抗：兔抗鼠PCNA单克隆抗体（1：100）过夜孵育，加入二抗孵育1 h，DAB显色，苏木素复染，常规脱水、透明、封片。高倍视野下观察PCNA染色情况。以一抗生成商提供的PCNA表达阳性的组织切片为阳性对照，采用PBS代替一抗作为阴性对照。结果观察：PCNA主要在子宫内膜腺上皮细胞的胞浆中表达，镜下呈棕黄色的颗粒为阳性细胞。采用Riosens Digital Imaging SystEMT系统分析图像灰度值，灰度值越高表明阳性表达量越低，灰度值越低表明阳性表达越高。

1.2.6 免疫组化测定在位内膜微血管密度（microvessel density，MVD） 采用常规SP法测定MVD（通过CD34）：将石蜡切片常规脱蜡、水化，加入过氧化氢孵育15 min灭活内源性酶，将切片浸入枸橼酸盐缓冲液热修复抗原，加入血清封闭液室温放置15 min，加入一抗即兔抗鼠CD34单克隆抗体（1：200）过夜孵育，加入二抗孵育30 min，DAB显色，苏木素复染，盐酸乙醇分化，氨水返蓝，常规脱水、透明、封片。以血管瘤组织切片为阳性对照，以PBS代替一抗为阴性对照。采用WEIDNER法［6］计数高倍视野下MVD。

1.2.7 Western blot测定在位内膜组织中cyclin D1、VEGF、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白水平 将在位内膜组织剪碎，加入RIPA裂解液，提取总蛋白，采用BCA法测定总蛋白浓度，每孔上样30 μg，经电泳分离、转膜，脱脂奶粉封闭，加入一抗（1：200）兔抗鼠cyclin D1单克隆抗体、兔抗鼠VEGF单克隆抗体、兔抗鼠JAK2单克隆抗体、兔抗鼠p-JAK2单克隆抗体、兔抗鼠STAT3单克隆抗体、兔抗鼠p-STAT3单克隆抗体过夜孵育，加入二抗（1：3 000）孵育1 h，ECL发光，扫描图像，以β-actin为内参，Image J分析条带灰度值。目标蛋白水平=目标蛋白条带灰度值∕β-actin条带灰度值。

1.3 统计学分析 采用SPSS20.0软件进行分析，异位病灶重量和体积、在位内膜厚度、PCNA灰度值、MVD值以及cyclin D1、VEGF、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白水平经检验符合正态分布，以均±s表示，各组间比较采用单因素方差分析，组内两两比较采用LSD检验，取P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度SFN对大鼠异位病灶重量和体积比较 各组大鼠异位病灶重量和体积比较差异有统计学意义（P＜0.05）。不同浓度SFN组大鼠异位病灶重量和体积均较小于模型组（P＜0.05），且SFN对大鼠异位病灶重量和体积的影响呈剂量依赖性。因3种剂量治疗均有疗效，故本文采用中剂量SFN 10 mg∕kg组进行后续研究。见表1。

表1 各组大鼠异位病灶重量和体积比较（±s，n=12）Tab.1 Comparison of weight and volume of ectopic le⁃sions of in rats each group（±s，n=12）

表1 各组大鼠异位病灶重量和体积比较（±s，n=12）Tab.1 Comparison of weight and volume of ectopic le⁃sions of in rats each group（±s，n=12）

Note：Compared with M group，1）P＜0.05.

Groups M SFN 5 mg∕kg SFN 10 mg∕kg SFN 15 mg∕kg F P Weight（mg）148.37±22.46 117.35±18.731）103.24±19.021）86.54±18.431）21.197＜0.001 Volume（mm3）115.34±13.21 83.24±12.631）75.31±11.681）67.52±11.821）34.681＜0.001

2.2 各组大鼠在位内膜厚度比较 各组大鼠在位内膜厚度比较差异有统计学意义（P＜0.05），SFN 10 mg∕kg组大鼠在位内膜厚度小于M组（P＜0.05）。见表2。

2.3 各组大鼠在位内膜组织中PCNA蛋白表达情况 各组大鼠在位内膜组织中PCNA蛋白水平比较差异有统计学意义（P＜0.05），M组大鼠在位内膜组织中PCNA蛋白灰度值低于C组（P＜0.05），SFN 10 mg∕kg组大鼠在位内膜组织中PCNA蛋白灰度值高于M组（P＜0.05）。见表2、图1。

图1 免疫组化测定各组大鼠在位内膜组织中PCNA蛋白表达（×400）Fig.1 Immunohistochemistry determination of PCNA protein expression in eutopic endometrial tissue of rats in each group（×400）

2.4 各组大鼠在位内膜组织中MVD值 见表2、图2，各组大鼠在位内膜组织中MVD值比较差异有统计学意义（P＜0.05），M组大鼠在位内膜组织中MVD值高于C组（P＜0.05），SFN 10 mg∕kg组大鼠在位内膜组织中MVD值低于M组（P＜0.05）。

表2 各组大鼠在位内膜厚度、PCNA灰度值、MVD值比较（±s，n=12）Tab.2 Comparison of eutopic endometrial thickness，PC⁃NA gray value and MVD value of rats in each group（±s，n=12）

表2 各组大鼠在位内膜厚度、PCNA灰度值、MVD值比较（±s，n=12）Tab.2 Comparison of eutopic endometrial thickness，PC⁃NA gray value and MVD value of rats in each group（±s，n=12）

Note：Compared with C group，1）P＜0.05；compared with M group，2）P＜0.05.

Groups CM SFN 10 mg∕kg FP Eutopic endometrial thickness（μm）476.13±15.76 528.16±16.351）492.89±15.371）2）33.769＜0.001 PCNA gray 132.14±12.07 75.32±11.261）93.61±11.381）2）75.342＜0.001 MVD（pcs∕HP）9.71±1.56 15.32±1.621）13.24±1.471）2）40.111＜0.001

图2 免疫组化测定各组大鼠在位内膜组织中MVD（×400）Fig.2 Immunohistochemistry determination of MVD in eu⁃topic endometrial tissue of rats in each group（×400）

2.5 各组大鼠在位内膜组织中cyclin D1和VEGF蛋白表达 各组大鼠在位内膜组织中cyclin D1和VEGF蛋白水平比较差异有统计学意义（P＜0.05），M组大鼠在位内膜组织中cyclin D1和VEGF蛋白水平高于C组（P＜0.05），SFN 10 mg∕kg组大鼠在位内膜组织中cyclin D1和VEGF蛋白水平低于M组（P＜0.05）。见表3、图3。

表3 各组大鼠在位内膜组织中cyclin D1和VEGF蛋白水平比较（±s，n=12）Tab.3 Comparison of cyclin D1 and VEGF protein levels in eutopic endometrial tissue of rats in each group（±s，n=12）

表3 各组大鼠在位内膜组织中cyclin D1和VEGF蛋白水平比较（±s，n=12）Tab.3 Comparison of cyclin D1 and VEGF protein levels in eutopic endometrial tissue of rats in each group（±s，n=12）

Note：Compared with C group，1）P＜0.05；compared with M group，2）P＜0.05.

Groups CM SFN 10 mg∕kg F P cyclin D1 0.09±0.03 0.64±0.071）0.25±0.061）2）306.511＜0.001 VEGF 0.12±0.04 0.51±0.061）0.31±0.071）2）135.564＜0.001

图3 Western blot测定各组大鼠在位内膜组织中cyclin D1和VEGF蛋白水平Fig.3 Western blot determination of cyclin D1 and VEGF protein levels in eutopic endometrial tissue of rats in each group

2.6 各组大鼠在位内膜组织中JAK2∕STAT3信号通路相关蛋白表达 各组大鼠在位内膜组织中JAK2、STAT3蛋白水平比较差异无统计学意义（P＜0.05）；各组大鼠在位内膜组织中p-JAK2、p-STAT3蛋白水平比较差异有统计学意义（P＜0.05），M组大鼠在位内膜组织中p-JAK2、p-STAT3蛋白水平高于C组（P＜0.05），SFN 10 mg∕kg组大鼠在位内膜组织中p-JAK2、p-STAT3蛋白水平低于M组（P＜0.05）。见表4、图4。

表4 各组大鼠在位内膜组织中JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白水平比较（±s，n=12）Tab.4 Comparison of JAK2，p-JAK2，STAT3 and p-STAT3 protein levels in eutopic endometrial tissue of each group of rats（±s，n=12）

表4 各组大鼠在位内膜组织中JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白水平比较（±s，n=12）Tab.4 Comparison of JAK2，p-JAK2，STAT3 and p-STAT3 protein levels in eutopic endometrial tissue of each group of rats（±s，n=12）

Note：Compared with C group，1）P＜0.05；compared with M group，2）P＜0.05.

Groups CM SFN10 mg∕kg F P JAK2 0.39±0.06 0.40±0.07 0.37±0.08 0.564 0.574 p-JAK2 0.08±0.02 0.37±0.051）0.17±0.031）2）208.737＜0.001 STAT3 0.33±0.07 0.34±0.06 0.32±0.07 0.269 0.766 p-STAT3 0.09±0.02 0.54±0.091）0.18±0.031）2）217.149＜0.001

图4 Western blot测定各组大鼠在位内膜组织中JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白水平Fig.4 Western blot determination of JAK2，p-JAK2，STAT3 and p-STAT3 protein levels in eutopic endo⁃metrial tissue of each group of rats

3 讨论

在EMT发病的多种学说中，经血逆流学说占主导地位，在位内膜异常在EMT的发生发展中的作用越来越受到重视，“在位内膜决定论”证实基于对EMT在位内膜在其发病中的作用提出的假说［7］。本研究发现EMT模型大鼠动情期子宫内膜厚度大于对照组，表明EMT造模可改变子宫内膜微环境，可促进在位内膜增殖。子宫内膜的厚度和内膜细胞的增殖关系密切，PCNA为细胞增殖的标志，其表达升高表明细胞增殖能力增强；cyclin D1的主要功能为促进细胞增殖，其水平升高在一定程度上也可反映细胞增殖能力。血管生成为EMT种植生长维持的必要条件，MVD为评价血管生成的指标，其值越高表明毛细血管越丰富；VEGF为促血管生成因子，其水平越高表明促血管生成作用越强。本研究发现EMT模型大鼠动情期在位内膜组织PCNA、cyclin D1、MVD、VEGF均升高，表明EMT造模可导致在位内膜细胞增殖能力和血管生成能力增强，抑制在位内膜细胞增殖和血管生成有助于EMT治疗。

SFN为西兰花属植物中提取的生物活性物质，是比较强的抗氧化能力物质之一，除了抗氧化作用，其在调节炎症反应、诱导细胞凋亡、抑制细胞增殖、恶性肿瘤的多种疾病的防治，卵巢早衰、卵巢癌等女性生殖系统疾病中都发挥重要作用［8-10］。本文针对SFN对EMT的作用进行研究，发现SFN可抑制EMT异位病灶的重量和体积，表明SFN对EMT具有治疗作用。

多种研究发现SFN具有抑制细胞增殖的作用，如研究发现SFN可抑制卵巢癌、犬骨肉瘤、人皮鳞状细胞癌细胞的增殖［11-13］。SFN在抑制血管生成中也发挥重要作用，如SFN可抑制黑色素瘤的血管生成发挥抗黑色素瘤体内生长的能力，通过促进细胞凋亡、抗血管生成、调节细胞周期等在恶性肿瘤的治疗中发挥作用［14-15］。上述研究表明SFN可通过抑制血管生成发挥对恶性肿瘤生长的抑制作用。基于EMT在位内膜的增殖和血管生成在EMT发病中发挥重要作用，SFN具有抑制细胞增殖和血管形成的作用。在EMT动物模型研究中发现造模可引起在位内膜在细胞生长、细胞侵袭、血管生成、性激素代谢等方面异常，表明异位病灶可引起在位内膜的生物学特征异常［16］；如果治疗EMT的药物在治疗异位病灶的同时可纠正在位内膜的异常状态，可有助于EMT的治疗，在防治EMT复发方面可能也具有一定作用。本文研究发现SFN可降低在位内膜组织中PCNA、cyclin D1、MVD、VEGF水平，表明SFN对EMT在位内膜细胞增殖和血管生成具有抑制作用。分析SFN在治疗EMT异位病灶的同时，可抑制EMT细胞增殖和血管生成发挥纠正EMT在位内膜的异常状态，从而发挥对EMT的保护作用。

SFN可通过多种信号通路发挥作用，如SFN可通过JAK2∕STAT3抑制脂多糖诱导心肌细胞肥大；SFN通过JAK2∕STAT3信号通路发挥缺血再灌注心肌细胞的保护作用［17-19］。JAK2∕STAT3参与EMT的发病过程，可调控子宫内膜异位细胞的迁移和侵袭［20-21］。SFN是否通过JAK2∕STAT3信号通路发挥对EMT的保护作用？本研究发现SFN可降低EMT在位内膜组织中p-JAK2、p-STAT3水平，表明SFN可抑制EMT在位内膜组织中JAK2∕STAT3信号通路的激活。研究发现JAK2∕STAT3参与细胞增殖和血管形成过程，故推测SFN可能通过抑制JAK2∕STAT3信号通路激活抑制在位内膜细胞增殖和血管形成，从而发挥对EMT的保护作用［22-23］。

综上所述，SFN可能通过对EMT在位内膜细胞增殖和血管生成的抑制作用发挥对EMT的保护作用，其机制可能与SFN抑制在位内膜组织中JAK2∕STAT3信号通路的激活有关。