PRDM1调控NF-κB信号通路对巨噬细胞极化和功能的影响①

张梦莹 李 志 李雪琴 钟 民 吕 坤

（皖南医学院第一附属医院弋矶山医院中心实验室，芜湖241001）

巨噬细胞作为一种极具可塑性和多能性的细胞群体，在免疫反应中发挥着不可替代的作用［1-3］。在机体微环境不同刺激物的影响下，可向不同类型分化且功能各异（主要分为M1型和M2型）［4-5］。B淋巴细胞诱导成熟蛋白-1（B-lymphocyte induced maturation protein-1，Blimp-1），又称为PR结构域蛋白1，已知它在B淋巴细胞终末分化为浆细胞并分泌大量免疫因子的过程中发挥关键作用，从而调控机体的免疫状态［6-7］。并且正性调节区锌指蛋白1（positive regulatory domain zinc finger protein 1，PRDM1）在人和小鼠的T细胞中均有表达，且高表达于CD4+和CD8+细胞系的效应及记忆细胞中［8-9］。同时PRDM1在调节T细胞的稳态上也发挥关键作用［10-11］。由此提示PRDM1可能与T细胞的分化和功能密切相关。因此本课题组前期实验中通过芯片微阵列分析数据（国家生物技术信息中心数据库登录号：GSE81922）筛查发现，小鼠骨髓来源巨噬细胞（bone marrow-derived macrophages，BMDMs）体外极化过程中，PRDM1表达存在差异，与M1相比，M2中PRDM1下调表达最为明显，提示其与巨噬细胞体外极化密切相关［12］。核转录因子κB（nuclear transcription faetor，NF-κB）是一种可以调控基因转录的核因子，被认为是巨噬细胞极化的重要调控因子，参与了TLR诱导的M1极化［13-14］。因此，本研究以巨噬细胞为研究对象，构建过表达腺病毒PRDM1，探索PRDM1是否通过调控NF-κB信号通路影响BMDMs的极化，为其在巨噬细胞极化的调控作用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 胎牛血清、2.5 g∕L胰蛋白酶（Gibco公司），高糖DMEM培养液（Hyclone公司），Trizol（美国Invitrogen公司），First-Strand cDNA Synthesis试剂盒、核蛋白-胞浆蛋白抽提试剂盒（美国Thermo公司），PCR试剂盒（广州锐博公司），过表达PRDM1腺病毒载体（上海汉恒生物科技有限公司），F4∕80、CD11b单克隆抗体（BD公司），PRDM1、p-IKK、IKK、p65、p-p65、β-actin、Histone单克隆抗体（Abcam公司），辣根过氧化物酶标记的二抗（Biosharp公司），蛋白浓度测定试剂盒（碧云天生物科技公司），ECL发光试剂盒（美国Millipore公司）。

1.2 方法

1.2.1 BMDMs培养、体外诱导及鉴定 将小鼠颈椎脱位法处死，75%酒精消毒5～10 min，无菌获取双侧股骨和胫骨，用5 ml注射器吸取L929条件培养液（含有20%胎牛血清、20% L929小鼠成纤维细胞株培养3 d的上清、100 U∕ml链霉素、100 U∕ml青霉素），从骨干的一端刺入骨髓腔，将骨髓冲洗到一无菌培养皿中，并将细胞充分混匀，分至6孔培养板中。在L929条件培养液中培养7 d后去除悬浮细胞，保留贴壁细胞。再加入新鲜的完全培养液RPMI1640继续培养1 d后即为BMDMs，同时消化收集一部分细胞进行流式细胞仪检测。第8 d后吸去上清以PBS缓冲液洗涤2遍，加入新的DMEM完全培养 液，IFN-γ（100 U∕ml）∕LPS（100 ng∕ml）或IL-4（20 ng∕ml）共同刺激培养48 h，诱导出M1∕M2型巨噬细胞。然后用Trizol裂解细胞提取总RNA，实时定量PCR检测M1∕M2型特异性表面分子。

1.2.2 腺病毒感染巨噬细胞 将原代BMDMs在6孔板中培养1周后随机 分 成2组：PRDM1 AdV组和阴性对照（NC）组，感染前吸出完全培养基，PBS洗涤2遍，每孔加入1 ml新鲜培养基，将10 μl PRDM1过表达腺病毒载体（1.26×1010PFU∕ml）和对照病毒载体分别滴入对应的培养孔中，轻轻混匀，感染6～8 h后更换新鲜的完全培养基，继续于37℃、5%CO2培养箱中培养48～72 h。

1.2.3 ELISA检测细胞培养液上清中炎症因子的分泌 收集各组培养的细胞上清液，以1 500 r∕min离心10 min，保留细胞上清液。按照试剂盒说明书进行操作，酶标仪检测样品450 nm波长下测定光密度OD值，实验重复3次。

1.2.4 巨噬细胞杀伤功能的检测 将腺病毒感染原代BMDMs 48 h后，加入0.1×106cfu∕ml大肠杆菌（BL21DE3pLysS）至96孔板，并在37℃下孵育1 h。收集上清液，置于37℃的罗勒氏肉汤琼脂平板上培养24 h，并计数细菌菌落。数据以cfu∕ml表示细菌菌落稀释因子∕平板稀释的上清液的体积。

1.2.5 巨噬细胞吞噬功能的检测 将腺病毒感染原代BMDMs 48 h后，用PE标记的微粒（MPs）分别添加到细胞孔中（500 μg∕孔），细胞培养箱中孵育24 h。再用冷PBS洗涤2次后，从孔中收获细胞，并用PE-Cy7标记的抗小鼠F4∕80抗体染色。最后在CytomicsTMFC500流式细胞仪（Beckman）上采集细胞。PE阳性细胞的百分比及其荧光强度使用Flow-Jo软件进行计算。

1.2.6 总RNA提取、反转录及实时定量PCR收集细胞 采用Trizol提取总RNA，按反转录试剂盒说明书反转录合成cDNA，行荧光定量PCR检测。引物序列见表1。实验数据以BIO-RAD CFX Manager分析软件进行自动分析。使用2-ΔΔCt法计算各组基因的表达水平情况。

表1 RT-qPCR引物序列Tab.1 Primer sequences of RT-qPCR

1.2.7 Western blot用4℃预冷的PBS缓冲液洗涤细胞3次，加入适量的含蛋白酶抑制剂复合物的RIPA裂解液于冰上裂解30 min，4℃、12 000 r∕min离心20 min，取上清，BCA法测定蛋白浓度。蛋白定量后经SDS-PAGE分离转至PVDF膜，用含5%脱脂奶粉4℃缓慢摇动孵育过夜，分别加一抗，4℃孵育过夜，经TBST洗涤3次，每次5 min；室温用二抗（辣根过氧化物酶标记，稀释比例为1∶2 000）孵育1～2 h，TBST冲洗，ECL显影发光。

1.3 统计学分析 采用统计分析软件GraphPad Prism 4.0计算各组数据的平均值和标准差，各组数据以±s表示，多组间差异比较采用单因素方差分析，P＜0.05视为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 对体外极化的巨噬细胞的鉴定BMDMs体外诱导8 d后，利用流式细胞术对细胞进行鉴定（图1A）。再分别给予IFN-γ∕LPS和IL-4刺激48 h，提取总RNA对M1、M2巨噬细胞相关标志基因进行RTqPCR检测，结果显示，刺激之后M1型和M2型所持有的标志基因的表达有明显升高（图1B，P＜0.05）。经流式细胞仪及RT-qPCR检测，证实体外诱导的巨噬细胞极化成功。

图1 体外极化巨噬细胞的鉴定Fig.1 Identification of polarized macrophages in vitro

2.2 PRDM1在M1和M2巨噬细胞中的相对表达水平 为了证实数据库筛选结果，应用荧光定量PCR和Western blot检测M1、M2中PRDM1基因和蛋白的表达情况。以M1巨噬细胞的表达为对照，结果显示，PRDM1在M2巨噬细胞中的表达明显低于M1巨噬细胞（图2，P＜0.05）。

图2 PRDM1在巨噬细胞中的表达情况Fig.2 Expression level of PRDM1 in macrophages

2.3 过表达PRDM1对巨噬细胞极化的影响BMDMs感染PRDM1过表达腺病毒载体48 h后，镜下观察细胞的腺病毒感染情况（图3A）；荧光定量PCR检测结果显示，PRDM1过表达后BMDMs（PRDM1 AdV组）中PRDM1的mRNA表达水平较阴性对照组（NC组）显著升高（图3B，P＜0.001）；Western blot结果显示，PRDM1 AdV组BMDMs中PRDM1蛋白的表达水平较阴性对照组明显升高（图3C、D，P＜0.05）。细胞感染腺病毒48 h后，再分别给予IFN-γ∕LPS和IL-4刺激48 h。通过荧光定量PCR检测结果显示，过表达PRDM1后M1型巨噬细胞表面分子iNOS、IL-12及TNF-α表达升高（图3E，P＜0.01），而M2型巨噬细胞表面分子Arg1、YM-1及FIZZ1表达降低（图3F，P＜0.05）。以上结果提示PRDM1可能参与调节巨噬细胞极化的过程。

图3 过表达PRDM1对巨噬细胞极化的影响Fig.3 Effect of PRDM1 overexpression on polarization of macrophages

2.4 过表达PRDM1对巨噬细胞功能的影响 将PRDM1过表达腺病毒（PRDM1 AdV组）和阴性对照（NC组）瞬时感染BMDMs 48 h后，再分别给予IFN-γ∕LPS和IL-4刺激48 h。ELISA检测结果显示，较NC阴性对照组，PRDM1 AdV组M1细胞上清中TNF-α、IL-12的表达水平上调，而M2细胞上清中IL-13的表达水平下调（图4A，P＜0.05）；细菌杀伤试验显示，过表达PRDM1显著增强了BMDMs的杀菌活性（图4B，P＜0.05）；吞噬试验显示，过表达PRDM1可降低BMDMs的吞噬能力（图4C，P＜0.05）。结果表明与PRDM1过表达对M1和M2极化表型影响一致。

图4 过表达PRDM1对巨噬细胞功能的影响Fig.4 Effect of PRDM1 overexpression on function of macrophages

2.5 过表达PRDM1促进NF-κB信号通路活化Western blot结果显示，在M2型巨噬细胞中过表达PRDM1，NF-κB信号通路中的下游信号分子p65及IKK的磷酸化水平较NC组显著升高。再核质分离提取细胞核蛋白，测定核内p65表达水平，结果显示过表达PRDM1后核内p65含量较NC组显著升高（图5，P＜0.05）。以上数据表明，PRDM1可能通过影响NF-κB信号通路的活化参与调控巨噬细胞M1极化。

图5 过表达PRDM1促进NF-κB信号通路活化Fig.5 Overexpression of PRDM1 promotes activation of NF-κB signaling pathway

3 讨论

巨噬细胞作为机体免疫系统的重要组成部分，在慢性和急性炎症中都能发挥重要的作用［15-16］。根据不同的刺激因素作用，可将活化的巨噬细胞分为M1和M2两大类型，M1型巨噬细胞具有较强的促炎和抗原提呈能力，参与诱导Th1型免疫应答，直接吞噬和杀伤病原微生物，同时通过分泌促炎细胞因子和趋化因子参与炎症反应［17］；而M2型巨噬细胞具有抑制炎症的作用，能促进组织的修复和血管再生，并能促进肿瘤的发展，通过分泌TGF-β和IL-10等抑制性细胞因子下调免疫反应从而有效控制炎症［18-19］。识别这两种巨噬细胞的方式主要是通过对其特异性高表达的标志分子检测来鉴别，iNOS、IL-12及TNF-α可用于鉴定M1型巨噬细胞，而Arg1、YM-1及FIZZ1是鉴定M2型巨噬细胞较为理想的标志分子［20］。巨噬细胞分泌适当的细胞因子和趋化因子可导致微环境的改变，以桥接固有免疫和适应性免疫反应。因此，通过调控巨噬细胞的极性达到免疫平衡将成为治疗炎症相关疾病的有效手段。

小鼠PRDM1基因全长5.1 kb，位于10号染色体，人的PRDM1基因位于6号染色体q21-q22.1位置上，全长29 kb，含有相同的结构区域。在中性粒细胞、B细胞、T细胞、巨噬细胞、上皮细胞以及肌细胞等都能检测到PRDM1的表达［21］。KALLIES等［22］和MARTINS等［23］发现PRDM1对调节T细胞的稳态和功能具有重要作用。另外，PRDM1蛋白在CD4+和CD8+的T细胞中表达增加［24-25］。提示PRDM1对T细胞的分化有一定影响。为探究PRDM1对巨噬细胞极化的作用，本文通过过表达巨噬细胞中PRDM1发现，PRDM1不仅调节M1和M2表型标记的表达，而且还可以控制M1∕M2相关的巨噬细胞功能。过表达PRDM1能够增加巨噬细胞中促炎因子TNF-α、IL-12的表达，并减少巨噬细胞中抗炎因子IL-13的表达；同时增强了BMDMs的杀菌活性，而降低了巨噬细胞吞噬凋亡细胞的能力。这与M1∕M2巨噬细胞典型特性相关［26-27］。上述数据表明巨噬细胞中PRDM1的过表达可以抑制M2的表型，促进巨噬细胞向M1极化。

已知NF-κB信号通路是参与炎症反应的“明星通路”，与炎症免疫调节反应密切相关，巨噬细胞M1极化和炎症反应需要NF-κB的参与［28-34］。而磷酸化是NF-κB基于激活的关键步骤。在本研究中，通过初步观察信号通路激活情况，发现在M2中过表达PRDM1，与阴性对照组相比，NF-κB信号通路中的下游信号分子p65、IKK的磷酸化水平明显升高，且核内p65含量也明显升高，提示NF-κB信号通路可能参与了PRDM1调控巨噬细胞极化和功能的过程。

综上所述，PRDM1介导的NF-κB信号通路可能在巨噬细胞极化过程中扮演重要角色，至于PRDM1在不同巨噬细胞中差异表达的原因，还需要进一步研究。