LC-MS/MS法测定木香槟榔丸中7个有效成分的含量

伏光耀，张小龙，陈洪岩

1 连云港经济技术开发区市场监督管理局，连云港 222069;2 江苏食品药品职业技术学院，淮安 223003；3 连云港市食品药品检验检测中心，连云港222006

木香槟榔丸主要由木香、槟榔、枳壳（炒）、陈皮、青皮（醋炒）、香附（醋制）、醋三棱、莪术（醋炙）、黄连、黄柏（酒炒）、大黄、炒牵牛子、芒硝等13 味中药制得，可行气导滞、泻热通便，用于治疗湿热内停、赤白痢疾、里急后重、胃肠积滞、脘腹胀痛、大便不通等相关症状[1]。该制剂中常见的有效成分有去氢木香内酯、α-香附酮、氢溴酸槟榔碱、盐酸小檗碱、橙皮苷、大黄素、大黄酚等。这些成分对人体有重要的药理作用。目前，《中国药典》2020 年版一部对木香槟榔丸的质量控制仅用薄层色谱法鉴别，并没有相关有效成分的含量控制。在文献报道中，有对木香槟榔丸中枳壳的质量控制，主要采用高效液相色谱法对枳壳中的橙皮苷的含量测定，或者对木香槟榔丸中木香烃内酯和去氢木香内酯的含量测定[1～3]。对上述提到的木香槟榔丸中7个常见有效成分只测定其中一种或者两种成分[4～6]，而未见对上述7 个成分同时测定的报道。本文同时测定了木香槟榔丸7 个成分的含量，完善了木香槟榔丸的质量控制。

1 仪器与药品、试剂

1.1 仪器

LC-30 超高效液相色谱仪（包括SIL-30A 型自动进样器、LC-30AD 二元输液泵、真空脱气机、CTO-30A 柱温箱），日本岛津公司；QTRAP 5500 型三重四级杆质谱仪，美国AB Sciex 公司；AG135 型十万分之一电子分析天平，瑞士Mettler-Toledo 公司；Agilent1260Infinity HPLC（配备DAD 检测器、二元泵系统、高通量自动进样器）；Agilent-Mass QTOF（电喷雾离子源、正负离子模式）。

1.2 药品与试剂

对照品：去氢木香内酯（批号：111525-201912，纯度99.5%）、α-香附酮（批号：110748-202016，纯度99.4%）、氢溴酸槟榔碱（批号：111684-202003，纯度99.8%）、盐酸小檗碱（批号：110713-202015，纯度85.9%）、橙皮苷（批号：1110721-202019，纯度95.3%）、大黄素（批号：110756-201913，纯度96.0%）、大黄酚（批号：110796-201922，纯度99.4%）均由中国食品药品检定研究院提供。供试品：木香槟榔丸（厂家提供，批号：18081488、18071871、19051395）。

甲醇、乙腈、乙醇、甲酸均为色谱纯；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent Poroshell 120 SB C18（2.1 mm×100 mm，2.7 μm）；以0.1%甲酸水溶液为流动相A，乙腈流动相B（按表1 进行梯度洗脱）；柱温：30 ℃；流速：0.30 mL·min-1；进样量：1.0 μL。

2.2 质谱条件

离子源为电喷雾电离源（ESI）；正负离子模式；采用多反应监测（MRM）模式；毛细管电压为5500 V（正离子模式）、-4500 V（负离子模式），脱溶剂温度为550 ℃，气帘气压力为35 psi，雾化器与干燥气的压力均为55 psi；离子源所用氮气纯度≥95%，碰撞气纯度≥99.999。7 个待测组分的离子对质谱优化条件见表2。

2.3 对照品溶液的制备

精密称取氢溴酸槟榔碱、α-香附酮、去氢木香内酯、盐酸小檗碱、橙皮苷、大黄素、大黄酚对照品适量，分别置于100 mL 量瓶中，用甲醇溶解并定容，摇匀，制备成浓度分别为209.6、190.4、208.0、182.3、133.1、135.6、211.9 μg·mL-1的储备液。

精密吸取上述7 个成分的对照品储备液各1.0mL，置于同一200 mL 的量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，制得混合对照品溶液Ⅰ。再精密吸取混合对照品溶液I 为5mL，置10mL 量瓶中，用甲醇稀释至刻度，制成每1 mL 分别含有上述成分524.0、476.0、520.0、455.8、332.8、339.0、529.8ng 的混合对照溶液Ⅱ。

2.4 供试品溶液的制备

取本品适量，研细，精密称取约1.0 g，置150 mL的烧瓶中，用移液管精密加入50%甲醇50 mL，称定重量，回流处理1.5 h，室温放置，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量中，摇匀，离心，取上清液。精密吸取上清液1 mL 置20 mL 量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，精密吸取上清液1 mL 置10 mL量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.5 阴性对照试验

按照木香槟榔丸处方[1]，制成只含醋三棱、莪术（醋炙）、炒牵牛子的阴性对照样品，按“2.4”项下方法制备阴性对照溶液。精密量取对照品溶液、供试品溶液与阴性对照溶液各1 μL，进样测定，色谱图见图1、图2。

图1 混合对照品溶液及供试品提取离子流色谱图

图2 阴性对照总离子流色谱图

2.6 线性关系考察

精密吸取上述混合对照品溶液Ⅰ适量，用甲醇稀释，配制成氢溴酸槟榔碱浓度为1048、524.0、104.8、52.40、26.20、10.48 ng·mL-1，α-香附酮浓度为952.0、476.0、95.20、47.60、23.80、9.520 ng·mL-1，去氢木香内酯浓度为1040、520.0、104.0、52.00、26.00、10.40 ng·mL-1，盐酸小檗碱浓度为911.5、455.8、91.16、45.58、22.79、9.116 ng·mL-1，橙皮苷浓度为665.5、332.8、66.56、33.28、16.64、6.656 ng·mL-1，大黄素为678.0、339.0、67.80、33.90、16.95、6.780 ng·mL-1，大黄酚为1060、530.0、106.0、53.00、26.50、10.60 ng·mL-1的系列溶液，进样测定其峰面积。以对照品浓度（ng·mL-1）为横坐标，各对照品峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得线性回归方程，结果见表3。

表3 线性回归方程与范围

2.7 进样精密度试验

精密吸取“2.3”项下混合对照品溶液Ⅱ，精密吸取1 μL，按“2.1”及“2.2”项下检测条件连续进样6次，记录峰面积。结果氢溴酸槟榔碱、α-香附酮、去氢木香内酯、盐酸小檗碱、橙皮苷、大黄素、大黄酚峰面积的RSD（n=6）分别为0.88%、1.95%、2.22%、0.40%、3.39%、1.44%、0.95%

2.8 稳定性试验

吸取“2.4”项下供试品溶液（批号：18081488）适量，分别在室温下放置0、4、8、12、16、20、24 h，进样检测，结果氢溴酸槟榔碱、α-香附酮、去氢木香内酯、盐酸小檗碱、橙皮苷、大黄素、大黄酚峰面积的RSD（n=6）分别为3.52%、1.89%、2.56%、2.17%、2.69%、1.45%、2.93%。

结果表明，供试品溶液中待测组分在室温下24h内稳定。

2.9 重复性试验

精密称取同一样品适量（批号：18081488）共6份，按“2.4”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样，结果氢溴酸槟榔碱、α-香附酮、去氢木香内酯、盐酸小檗碱、橙皮苷、大黄素、大黄酚平均含量分别为336.6、141.6、590.0、6356、2179、1108、962.1 μg·g-1，RSD 分别2.43%、1.25%、2.76%、0.87%、0.25%、0.97%、3.04%（n=6）。

2.10 加样回收率试验

取同一样品（批号：18081488）约0.5 g，共6 份，精密称定，分别精密加入各对照品储备液适量，按“2.4”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”及“2.2”项下检测条件进样，以样品称样量乘以各待测成分的平均含量，得到加标前原样品中各待测成分的含有量（以g 计），即基础值。

将图谱中得到的各待测成分色谱峰的峰面积代入其线性方程，计算得到供试品溶液中各待测成分的浓度，再乘以稀释倍数，计算出加标后样品中各待测成分的含有量（以g 计），即实测值。

将对照品储备液浓度乘以加标体积作为加标值（以g 计），以（实测值-基础值）/加标值100%计算各待测成分的回收率。结果表明，氢溴酸槟榔碱平均回收率为101.46%，RSD 为2.31%（n=6）；α-香附酮平均回收率为99.81%，RSD 为2.50%（n=6）；去氢木香内酯平均回收率为100.27%，RSD 为1.95%（n=6）；盐酸小檗碱平均回收率为97.94%，RSD 为1.47%（n=6）；橙皮苷平均回收率为98.74%，RSD 为2.13%（n=6）；大黄素平均回收率为99.17%，RSD 为3.33%（n=6）；大黄酚平均回收率为100.18%，RSD为1.85%（n=6）。

2.11 样品含量测定

取3 批木香槟榔丸样品各适量，按“2.4”项下方法分别制备供试品溶液，再按“2.1”及“2.2”项下检测条件进样，将供试品图谱中得到的各待测成分色谱峰的峰面积代入其线性方程，计算得到供试品溶液中各待测成分的浓度C，以浓度C 稀释倍数/（称样量×1000）计算样品各待测成分的含量（平行制备6 份样品，含量以6 份平行样品的平均含量计）。结果见表4。

表4 3 批样品含量测定结果（n=6，μg·g-1）

3 讨论

由于大黄素、大黄酚的[M+H]+峰响应均不是很高，且有大黄素、大黄酚在负离子模式下测定的文献报道[7，8]，本研究采用负离子模式测定样品中大黄素、大黄酚的含量。通过实验可知，大黄素、大黄酚的[M-H]-峰响应较高，故确定其采用负离子模式测定。

实验分别考察了甲醇、乙醇、50%甲醇作为提取溶剂，分别用超声法、回流法（0.5、1、1.5、2 h）、研磨法提取样品，结果表明，采用50%甲醇作溶剂，回流1.5h效果良好，可将待测组分提取完全且操作简便。