CYP3A5、UGT1A1、UGT2B7基因多态性与肾移植受者他克莫司血药浓度的相关性研究

张七妹，张馨云，钟诗龙*

1 三亚市人民医院，海南 572000；2 广东省人民医院，广东510000

钙调神经蛋白抑制剂他克莫司是肾脏移植术后抗排斥反应的一线用药[1]，而其血药浓度值是否达标，是移植肾长期存活率的重要影响因素。但他克莫司的治疗窗非常窄，血药浓度过低可能会诱发排斥反应，血药浓度过高又会导致毒副反应增加[2]。有关文献表明，遗传因素可对他克莫司血药浓度产生不同程度的影响，而研究较多的是：CYP3A4 和CYP3A5 以及转运蛋白的编码基因ABCB1；其中CYP3A4*18B 与他克莫司血药浓度显著相关[3]，而CYP3A4*22 在亚洲人群中突变率较低，CYP3A4*1B[4，5]与ABCB1[6，7]对他克莫司的影响尚存争议。目前公认CYP3A5 是参与他克莫司代谢的重要酶系，其影响是较为明确的：CYP3A5*3 在第3 内含子引起（6986A→G）突变，使得CYP3A5 纯合子（*3/*3）的人不表达CYP3A5[8]，从而影响他克莫司体内代谢，导致不表达该酶的患者血药浓度升高。因而临床药物基因组学实施联盟（CPIC）指南推荐肾移植受者根据CYP3A5 基因型调整他克莫司的初始给药剂量[9]。

然而，以上与他克莫司血药浓度相关的遗传因素研究皆集中在I 相代谢酶系和转运蛋白编码基因，葡萄糖醛酸基转移酶（UDP-glucuronosyltransferase，UGT）存在于许多脊椎动物中，是重要的II 相代谢酶之一。人类的UGT 超家族根据核苷酸序列的相似性分为两个家族：UGT1A 和UGT2[10]、UGT1A和UGT2 都参与了许多药物的代谢[11]，但其基因结构存在明显的差别,有研究显示[12，13]，他克莫司代谢过程会受UGT 酶影响。但对于Ⅱ相代谢酶与他克莫司的血药浓度相关性研究国内外非常有限。因此本研究主要针对CYP3A5*3、UGT1A1*6、UGT2B7*3、UGT1A1*28、UGT2B7*2 基因多态性与他克莫司血药浓度之间的相关性进行了探索，以便为肾移植术后个体化给药，提供更多用药依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与药品、试剂

西门子Viva-E 仪器（Siemens Healthcare Diagnostics Inc），Real -Time Fluorescent Quantitative Applied B-biosystems VIVA7（Life technologies，美国）；Applied B-biosystems VIVA7Emit®2000 他克莫司（型号：8R109UL）定标液；Emit®2000 他克莫司（型号：8R109UL）检测试剂；Emit®2000 他克莫司（型号：8R109UL）预处理试剂。血液/细胞/组织基因组DNA 提取试剂盒（离心柱型，目录号：DP304-03），TIANtough 基因分型PCR 试剂盒2×TaqMan®Universal PCR Master Mix（均为天根生化科技北京有限公司）。

1.2 研究对象

本研究纳入124 例2006 年9 月至2014 年9月在广东省人民医院首次进行肾移植手术的患者，其中男性85 例（占68.5%），女性39 例（占31.5%），全部为汉族；年龄为（42.31±1.27）岁，无儿童患者，体重（62.7±10.4）kg。本研究经广东省人民医院伦理委员会批准,所有患者均签署知情同意书。

1.3 纳入标准

术后均采用他克莫司（Astellas Ireland Co.，Ltd，日本）+霉酚酸酯（上海罗氏制药）+泼尼松（浙江仙琚制药）三联免疫抑制疗法：其中他克莫司0.1～0.12 mg·（kg·d）-1，每天2 次，再根据血药浓度作剂量调整；霉酚酸酯0.5～2.0 g·d-1，每天2 次，之后根据血药浓度调整剂量；泼尼松片60～20 mg·d-1。

排除范围：发生急性排斥反应患者；合并急性感染患者；多器官移植患者；肝功能异常患者；合并使用肾毒性药物（如两性霉素B 等）的患者；合用可能对他克莫司代谢有影响的药物[如酮康唑（CYP3A 酶抑制剂）、利福平（CYP3A 酶诱导剂）]的患者；妊娠和哺乳期妇女以及接受过鼠单克隆抗体诊断或治疗的患者。

1.4 他克莫司浓度检测

患者规律服用同一剂量他克莫司并连续7 天以上，采集清晨服药前（即末次给药后12 h）的静脉血2 mL，置于EDTA 抗凝真空管，全血样本、定标液和质控应用甲醇和Emit®2000 他克莫司样本以前处理试剂进行前处理，再将处理后的样本离心，最后取上清液，部分使用Emit®2000 他克莫司检测试剂（酶放大免疫测定法）进行测定。

1.5 基因型检测

先采取吸附柱离心提取法提取血样中DNA，使得所有样品DNA OD260/280 在1.7～1.9，以达到纯度要求。再采用TaqMan-MGB 探针法对提取的DNA 进行基因分型。采用Primer5.0 软件和Beacon Designer 7.91 Demo分别设计CYP3A5*3、UGT1A1*28、UGT1A1*6、UGT2B7*2、UGT2B7*3五个基因型，SNP 的引物和TaqMan 探针见表1。

表1 各基因型引物及探针序列

1.6 统计学处理

采用SPSS 19.0 软件进行统计分析。计量资料符合正态分布的数据采用均数±标准差（）表示，不符合正态分布的数据以M±Q 表示。以计数法计算各个基因型的等位基因频率，再根据Hardy-Weinberg 遗传平衡定律规则，即（p+q）2=1，即p2+2pq+q2=1 来计算各个基因型的理论频数，然后采用卡方检验，统计各等位基因频率是否符合Hardy-Weinberg 遗传平衡定律，P＞0.05 认为研究对象具体群体代表性；采用非参数检验Kruskal-Wallis H 检验法分析基因型等与他克莫司血药浓度的相关性，P﹤0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 他克莫司血药浓度分布

在纳入的124 例患者中，测得他克莫司血药浓度为（7.07±2.54）ng·mL-1。其中血药浓度低于5ng·mL-1的有27 例（占比21.8%），血药浓度高于10ng·mL-1的有11 例（占比8.9%），其中1 例高于20ng·mL-1。

2.2 等位基因与基因频率分布

分别对124 例肾移植受者的5 个SNPs 进行分型检测，经计数法统计，CYP3A5*3、UGT1A1*6、UGT1A1*28、UGT2B7*2、UGT2B7*3 的突变频率分别为66.9%、12.1%、15.7%、71.4%、59.7%。基因型及等位基因频率见表2，经Hardy-Weinberg 遗传平衡检验分析，其中CYP3A5*3、UGT1A1*6、UGT1A1*28、UGT2B7*2四个基因型结果显示P＞0.05，基因频率达到遗传平衡，表明研究资料具有群体代表性。而UGT2B7*3 显示P＜0.05，不符合Hardy-Weinberg 遗传平衡，可能与所选群体为疾病群体以及基因突变有关。

2.3 基因多态性与他克莫司血药浓度的相关性分析

按不同位点的基因型进行分组，以Kruskal-Wallis H 检验比较5 个SNPs 与他克莫司血药浓度的相关性，发现CYP3A5*3、UGT1A1*6、UGT2B7*3 基因多态性与他克莫司血药浓度存在相关性（见表2），而UGT1A1*28、UGT2B7*2 基因多态性与其血药浓度不相关，说明他克莫司血药浓度不受UGT1A1*28、UGT2B7*2 基因多态性影响，而可能与CYP3A5*3、UGT1A1*6、UGT2B7*3 基因多态性有关。

表2 5 个SNPs 的多态性与他克莫司血药浓度的相关性

3 讨论

他克莫司是肾移植受者抑制急性排斥反应的重要药物。大量药物基因组学研究显示，他克莫司的代谢及血药浓度与Ⅰ相代谢酶及转运蛋白有关；但II 相代谢酶与其血药浓度的相关性研究非常有限。本研究旨在探索Ⅱ相代谢酶UGT1A1*6、UGT1A1*26、UGT2B7*3 和UGT2B7*2 以 及I相代谢酶CYP3A5*3 与他克莫司血药浓度的相关性。结果显示，CYP3A5*3 是影响他克莫司血药浓度的最相关因素（P 值为0.001），与前人研究结果一致[14]，可能是目前最有效的他克莫司给药剂量预测指标。CYP3A 是人体内药物代谢的重要酶系，可参与45%～60%的临床药物代谢[15]；但是并不是唯一的代谢酶系，并不能解释所有的变异情况。

有研究显示[16]，在亚洲人群中，UGT1A1*6（G71R）基因变异频率较高（12%），且为东亚人群特有基因变异。UGT1A1*6 位于第1 外显子，可使UGT1A1 代谢功能降低。秦天等[17]研究提示，除经典药物代谢基因CYP3A5 外，UGT1A1 也可能对他克莫司的代谢产生影响作用。UGT2B7 主要表达于肝脏，底物广泛，其中UGT2B7*2（802C＞T）由于其发现最早、研究较深，却也最有争议[18-20]，而日本发现UGT2B7*3（211T＞C，A71S）位于底物结合域，是第一个发现的位于此结构域的基因变异，提示可能有功能意义。本研结果显示，UGT1A1*6 和UGT2B7*3 与他克莫司血药浓度有显著的统计学相关性（P 值分别为0.022 和0.014），可能是未来他克莫司血药浓度遗传因素相关研究的新的突破口。

在本研究中，UGT2B7*3 的基因型GG/GT/TT为27.4%/25.8%/47.8%，等位基因G 和T 的频率分别为40.3%和59.7%，与NCBI 数据库查得的0.852和0.148 不一致，不符合Hardy-Weinberg 遗传平衡定律，可能因为本研究纳入人群为疾病群体，且不能排除基因突变等因素，因此存在群体代表范围的局限性，后期仍需扩大样本量、拓宽研究范围（如群体药代动力学的相关研究等）作深入研究。