组蛋白去甲基化酶KDM5C在炎症性肠病中的作用研究

陈 萍 朱 华 余亚莉 毛宇娟 卓明星 陈 敏 叶 梅

炎症性肠病(IBD)是一种非特异性的肠道慢性炎性疾病，包括溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(CD)，其发病机制目前尚未完全明确。多项研究显示，表观遗传通过调控基因表达、影响炎性反应表型而参与IBD的发生、发展。UC患者结肠组织中总基因组DNA甲基化水平明显低于正常人，且其在疾病活动期的水平也明显低于非活动期[1]。Tsaprouni等[2]在2，4，6-TNBS诱导的慢性结肠炎小鼠和CD患者肠黏膜中均发现组蛋白H4(赖氨酸残基8、12位点)高乙酰化。用葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的急性结肠炎模型研究发现，结肠炎组织中一氧化氮合酶(iNOS)、IL-6和TNF-α等炎性因子呈高表达，其基因启动子区域H3K27ac的富集水平也显著升高[3]。

KDM5C是由X染色体编码转录的去甲基化酶，可以催化组蛋白H3K4me2/3脱甲基，使H3K4me2/3的激活转录作用减弱，在维持DNA准确复制、神经系统发育和肿瘤细胞增殖等方面起着重要作用[4]。近年来研究显示，KDM5C在结肠癌、前列腺癌和肝细胞癌中呈高表达[5-6]，在结肠癌细胞中沉默KDM5C可降低其对奥沙利铂的耐药性[7]。而在胆管细胞癌中，KDM5C可通过参与脂肪酸代谢抑制肿瘤细胞的侵袭和迁移[8]。目前尚未见KDM5C在自身免疫性疾病及炎性疾病中的相关研究报道。本研究用葡聚糖硫酸纳(DSS)诱导小鼠慢性结肠炎模型，检测KDM5C的表达变化，并利用KDM5C基因敲除(KDM5C-/-)小鼠建立急性结肠炎模型，探讨KDM5C在小鼠结肠炎进程中的作用及机制，为进一步研究KDM5C在结肠炎发病机制中的作用提供依据。

1 材料与方法

1.1 标本来源

收集2019年11月至2020年9月期间在武汉大学中南医院接受手术治疗的8例溃疡性结肠炎(UC)患者、10例克罗恩病(CD)患者的结肠黏膜组织标本，另选择7例结肠息肉患者的结肠黏膜组织标本作为正常对照。取材后将标本迅速保存于-80 ℃冰箱以备实时荧光定量PCR(real-time qPCR)等检测使用。所有患者均知情同意，本研究经医院医学伦理委员会批准。

1.2 实验动物

本研究采用26只无特定病原体(SPF)级C57BL/6野生型(WT)雄性小鼠，6～8周龄，体质量为18～22 g，由本院动物实验中心提供。KDM5C-/-小鼠雄性纯合子3只(C57BL/6小鼠)，6～8周龄，体质量为16～19 g，由武汉大学基础医学院李枫教授惠赠。小鼠饲养在SPF环境中，恒温(21 ℃～22 ℃)，12 h明暗循环，自由饮水饮食。在实验开始前，小鼠适应性喂养1周。

1.3 主要材料与试剂

葡聚糖硫酸钠(DSS)购自美国MP Biomedicals公司。多聚甲醛、H-E染液购自Biosharp公司。EASY spin组织/细胞RNA快速提取试剂盒购自北京艾德莱生物科技有限公司。逆转录试剂盒购自日本Toyobo公司。SYBR-Green real-time qPCR试剂盒购于康为世纪生物科技有限公司。引物由武汉擎科生物技术有限公司合成。

1.4 构建小鼠慢性结肠炎模型

将小鼠随机分为实验组1(n=10)和对照组1(n=10)。参照chen等[9]的方法构建慢性结肠炎模型。将DSS粉末溶于高压灭菌蒸馏水配制成2.5%DSS溶液，实验组1小鼠自由饮用2.5%DSS溶液7 d后饮用蒸馏水14 d，如此循环3次，末次给药后第5天处死小鼠，对照组1小鼠全程自由饮用蒸馏水。每天观察记录小鼠的体质量、粪便性状和粪便带血情况。于第54天断颈处死两组小鼠，解剖取出完整结肠，取2 cm远端结肠，用4%多聚甲醛溶液固定后行病理检查。将剩余结肠组织保存于-80 ℃冰箱备用。

1.5 构建小鼠急性结肠炎模型

将小鼠分为对照组2(WT小鼠)、实验组2(WT小鼠+3%DSS)和实验组3(KDM5C-/-小鼠+3%DSS)，每组3只小鼠。参照Bauer等[10]的方法构建小鼠急性结肠炎模型。将DSS粉末溶于高压灭菌蒸馏水配制成3%DSS溶液，实验组2和实验组3小鼠给予自由饮用3%DSS溶液7 d，对照组2全程自由饮用蒸馏水。每天观察并记录各组小鼠的体质量、粪便性状和粪便带血情况、毛色及活动状况。疾病活动指数评分(DAI)参照Wirtz 等[11]的评分标准，详见表1。于第8天断颈处死各组小鼠，取完整结肠，测量长度并拍照。取2 cm远端结肠，用4%多聚甲醛溶液固定后行病理检查。将剩余结肠组织保存于-80 ℃冰箱备用。

表1 DAI评估标准

1.6 小鼠结肠组织切片制备

处死小鼠后取0.5 cm远端结肠，置于4%多聚甲醛溶液中固定，经乙醇脱水，先行透明处理，再完成浸蜡、包埋、切片、烤片和切片脱蜡处理。脱蜡蒸馏水浸洗2 min后行H-E染色，染色完成后自来水洗涤，透明，封片。最后进行镜检及图像采集分析。

1.7 real-time qPCR检测

将收集的人体结肠标本、急性和慢性结肠炎模型小鼠的结肠组织称重，按照EASY spin组织/细胞RNA快速提取试剂盒操作说明书提取总RNA，根据OD260/OD280比值估测RNA质量，比值在1.8～2.0满足实验要求。取2 μg总RNA为模板逆转录成cDNA，高压灭菌蒸馏水稀释2倍，以GAPDH为内参，Real-time qPCR法检测KDM5C、TNF-α、干扰素-γ(IFN-γ)、IL-6和IL-1βmRNA的相对表达量。逆转录反应条件：65 ℃ 5 min，37 ℃ 15 min，98 ℃ 5 min。real-time qPCR反应条件：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性10 min，56 ℃～64 ℃退火30 s，72 ℃延伸，共40个循环。采用2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。每个实验至少重复3次，real-time qPCR引物序列见表2。

表2 引物序列

1.8 生物信息学数据获取

利用生物信息学技术分析KDM5C在IBD患者和正常人肠黏膜中的差异表达情况，从GEO数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下载IBD基因芯片数据集GSE6731，由Chakravarti等提交，共36个样本，包括13例UC患者、19例CD患者的肠黏膜组织及4名正常人的肠黏膜组织(正常对照者)。

1.9 统计学分析

采用Graphpad Prism 8.0软件进行统计学分析，数据以均值±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 IBD患者及正常对照者结肠组织中的KDM5C mRNA表达比较

利用Graphpad Prism 8.0软件对GSE6731数据集进行分析，结果显示与正常对照者相比，UC、CD患者结肠组织中的KDM5CmRNA相对表达量均明显降低，差异均有统计学意义(P均<0.05)，见图1A。采用real-time qPCR法检测UC、CD患者及结肠息肉患者(正常对照)的结肠组织，发现与结肠息肉患者相比，UC和CD患者结肠组织中的KDM5CmRNA相对表达量均明显降低，差异均有统计学意义(P均<0.05)，与生物信息学分析结果一致，见图1B。

2.2 慢性结肠炎模型小鼠结肠组织中的KDM5C mRNA相对表达量比较

采用real-time qPCR法检测实验组1和对照组1小鼠结肠组织中的KDM5CmRNA相对表达量，结果显示实验组1小鼠结肠组织中的KDM5CmRNA相对表达量显著低于对照组1，差异有统计学意义(P<0.05)，见图2。

注：与正常对照者比较，*P<0.05图1 UC、CD患者和正常对照者结肠组织中的KDM5C mRNA表达量比较 A GSE6731数据集分析 B real-time qPCR法测得的3组KDM5C mRNA相对表达量比较

注：与对照组1比较，*P<0.05图2 两组小鼠结肠组织中的KDM5C mRNA相对表达量比较

2.3 急性结肠炎模型小鼠疾病表现和炎性反应评估

本研究采用KDM5C-/-小鼠进一步研究KDM5C在结肠炎中的作用，结果显示与对照组2相比，实验组2的体质量在第3天开始持续下降，实验组3的体质量下降更为显著；第5天时实验组3与对照组2的的体质量差异显著(P<0.05)，第8天时实验组2与实验组3的体质量差异显著(P<0.05)；见图3A。此外，与对照组2相比，实验组2的DAI明显升高，实验组3的DAI升高更显著，且在第8天时实验组2与实验组3的DAI差异显著(P<0.05)，见图3B。于构建急性结肠炎模型第8天处死小鼠，分离出完整的结肠组织，观察大体组织学改变：与对照组2相比，实验组2大便稀软，结肠长度明显缩短且肠腔变细、僵硬和出血；实验组3肠腔出血和结肠缩短较实验组2更显著；见图3C、3D。结肠组织经H-E染色后光镜下观察(×100)示：与对照组2相比，实验组2小鼠结肠腺体结构紊乱、隐窝结构破坏，黏膜和黏膜下层水肿并伴有炎性细胞浸润；在实验组3小鼠肠组织中，这些炎性反应表型更为明显；见图3E。

注：与对照组2比较，*P<0.05；与实验组3比较，#P<0.05；与实验组2比较，+P<0.05图3 3组小鼠的疾病表现和炎性反应评估比较 A 体质量下降曲线 B DAI C 结肠长度 D 完整结肠标本 E 远端结肠病理图 H-E染色 ×100

2.4 KDM5C基因敲除对炎性因子表达的影响

为进一步研究KDM5C基因敲除加重结肠炎的潜在机制，本研究采用real-time qPCR法检测了急性结肠炎模型小鼠结肠组织中一些炎性因子mRNA相对表达量，结果显示，与对照组2相比，实验组2的KDM5CmRNA相对表达量明显下降，实验组3的KDM5CmRNA相对表达量极低，提示敲除成功；实验组2结肠组织中TNF-α、IFN-γ、IL-6和IL-1β的mRNA相对表达量均较对照组2明显升高(P均<0.05)；实验组3小鼠结肠组织中TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA相对表达量较实验组2进一步升高(P均<0.05)，而IFN-γ的mRNA相对表达量较实验组2也有所升高，但差异无统计学意义(P>0.05)。见图4。

注：与对照组2比较，*P<0.05；与实验组2比较，+P<0.05图4 3组小鼠结肠组织中炎性因子mRNA相对表达量的比较 A KDM5C B TNF-α C IFN-γ D IL-6 E IL-1β

3 讨论

近年来，越来越多的研究显示表观遗传修饰是免疫相关的炎性疾病的重要发病机制之一[12-13]。组蛋白去乙酰化酶抑制剂SAHA可显著缓解小鼠的慢性结肠炎和腹膜纤维化[14-15]。在DSS诱导的急性结肠炎小鼠体内注射组蛋白甲基化酶EZH2抑制剂，可增加骨髓来源的抑制性细胞(MDSC)富集，对缓解结肠炎及预防结肠炎相关结直肠癌有良好的疗效[16]。关于组蛋白去甲基化酶KDM5C在IBD中的作用尚未见研究报道。本研究发现在IBD患者和经DSS诱导的慢性结肠炎模型小鼠结肠组织中KDM5C转录水平均明显降低，提示KDM5C在结肠炎中可能发挥抑炎作用。进一步构建急性结肠炎模型，结果发现KDM5C-/-小鼠对DSS诱导的结肠炎较WT小鼠更易感，具体表现为小鼠体质量下降更快、DAI更高、结肠出血及缩短更明显、肠黏膜损伤更重。由此可见，KDM5C基因缺失加重了肠道炎性反应，提示KDM5C在IBD发病过程中发挥着抗炎作用。

肠黏膜免疫应答紊乱导致的细胞因子失衡是IBD发生、发展的核心环节。组蛋白修饰除了直接调控基因表达外，还与免疫调节、炎性反应等多种生物学功能有关。JMJD3是组蛋白H3K27的去甲基化酶，不仅参与Th17细胞的分化，还可促进巨噬细胞向M2型极化[17-18]。在脂多糖(LPS)刺激的巨噬细胞中，TET2通过招募组蛋白去乙酰化酶HDAC1/2，下调IL-6的表达，从而抑制炎性反应持续发展[19]。He等[20]发现泛素连接酶FBXW7可通过靶向降解EZH2增加CCL2、CCL7等趋化因子在结肠固有层聚集，从而加重肠道炎性反应。上述研究均证明组蛋白修饰可通过调节炎性因子参与IBD的发生、发展。近年来研究显示长链非编码RNA LOXL1-AS1通过KDM5C上调IL-6、IL-8的表达，从而加重骨关节炎[21]。TNF-α、IFN-γ、IL-6和IL-1β等炎性因子的过量产生与肠黏膜屏障损伤及肠道慢性炎性反应密切相关，抗TNF-α单抗已成为治疗IBD的重要手段并取得良好疗效，被纳入了国内外IBD治疗指南[22-23]。本研究采用real-time qPCR法检测了小鼠结肠组织中一些炎性因子mRNA的相对表达量，结果发现KDM5C基因缺失可诱导结肠组织中TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-1β的mRNA相对表达量明显升高，与上述结论一致，提示KDM5C可通过抑制炎性因子表达而发挥抗炎作用。

综上所述，KDM5C基因敲除可加重DSS诱导的结肠炎，这种效应可能是通过上调促炎因子的表达而实现的。本研究为进一步探讨KDM5C在结肠炎发病机制中的作用提供了依据和线索。然而，本研究尚存在不足：(1)KDM5C基因敲除后上调TNF-α、IL-6、IL-1βmRNA的表达是否通过调节H3K4三甲基化发挥作用，有待进一步研究；(2)本研究中KDM5C基因敲除小鼠数量较少，因全身性KDM5C基因敲除小鼠存在发育迟缓和雌性纯合子致死的问题，今后本课题组将培育更多的雄性纯合子KDM5C-/-小鼠，通过模式动物深入研究其在肠道炎性反应中的作用及具体机制。