食管鳞癌中CD137L表达及其与肿瘤转移和微血管密度的相关性

安秀英 胡锋超 张 晶 王 萍 窦 艳 张华英

食管鳞癌是指食管上皮鳞状细胞分化的恶性上皮性肿瘤，占食管癌95%，其发病率和病死率均较高，具体病因不明，可能与遗传、饮食习惯、抑癌机制缺陷等有关，目前治疗方式包括手术治疗、化学治疗、放射治疗及免疫治疗等[1-2]。CD137配体(CD137L)通过控制T细胞的转移、凋亡、杀伤毒性等达到抗肿瘤的效果，已成为食管鳞癌免疫治疗的研究热点[3-4]。CD105是独立存在于细胞表面的肿瘤新生血管的重要标志物[5]。虽然学者们已经开展了CD137/CD137L靶向治疗、肿瘤微血管密度(MVD)等的研究[6-7]，但在食管鳞癌中CD137L蛋白表达与肿瘤转移及MVD的相关性方面鲜见报道。本研究比较了80例食管鳞癌患者的鳞癌组织和癌旁正常组织中CD137L、CD105蛋白的表达并分析CD137L表达与MVD的相关性，探讨CD137L表达对肿瘤转移及MVD的意义，为免疫治疗研究、食管肿瘤进展机制研究提供理论基础。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2017年1月至2018年6月在河北省民政总医院外科住院手术的80例食管鳞癌患者的食管鳞癌组织和癌旁正常组织(距肿瘤边缘>5 cm)进行回顾性分析。男性45例，女性35例，年龄18～75岁，平均年龄为(57.38±6.94)岁。纳入标准：(1)首次就诊，未经其他治疗；(2)未见食管以外的肿瘤病灶；(3)经病理检查确诊为食管鳞癌，病理切片可见角质细胞样细胞之间存在细胞间桥，或伴有角化珠，患者肿瘤组织均存于本院病理科；(4)沟通交流无障碍。

1.2 方法

1.2.1 定量PCR检测 组织裂解后制备成匀浆，提取总RNA，制备实时荧光定量反应体系，进行定量PCR(qPCR)检测。qPCR反应程序：95 ℃ 3 min变性，95 ℃ 12 s，62 ℃ 40 s，共40个循环。检测食管鳞癌组织及癌旁正常组织中CD137LmRNA的相对表达量，以β-actin为内参，以2-△△Ct计算目的基因的相对表达量。所有操作步骤均严格按说明书进行。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.2.2 组织切片制备与观察 食管鳞癌组织和癌旁正常组织用4%中性甲醛固定4～6 h，组织经常规处理，包埋，切片，展平，烤片。光镜下复阅石蜡切片，重新诊断。记录肿瘤临床病理特征，包括组织学分级(Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级)，浸润深度(黏膜内、肌层、外膜)，有无淋巴结转移等，由两位病理医师判定结果。组织学分级参照《安徽省食管癌分级诊疗指南(2016版)》[8]：(1)Ⅰ级 癌细胞分裂有层次，癌巢中有明显角化珠、细胞内角化、发育良好的细胞问桥；(2)Ⅱ级 癌细胞分界尚清，癌巢周边核呈栅状排列，有细胞内角化及个别角化珠；(3)Ⅲ级 癌细胞大小不等，细胞间桥不明显，核异型性明显，核分裂多伴坏死。

1.2.3 免疫组织化学染色与各指标检测 每例蜡块连续切片，采用免疫组织化学SP法检测食管鳞癌组织及癌旁正常组织中CD137L、CD105蛋白的表达，操作步骤严格按说明书进行。依据染色强度及阳性细胞占比，分为阳性表达和阴性表达，由两位病理医师判定结果。阳性细胞：细胞膜、细胞质中可见黄色或棕黄色颗粒。每例切片在400倍光镜下随机选择5个视野，进行阳性细胞数占比计分(每个视野计数100个细胞)：<5%计0分；>5%且≤25%计1分；>25%且≤50%计2分；>50%且≤75%计3分；>75%计4分。依据阳性细胞着色程度计分：无着色计0分；淡黄色计1分；棕黄色计2分；褐黄色计3分。5个视野得分取均值，两种得分相乘得出免疫组织化学评分(IHS)：0～1分为阴性表达；2～12分为阳性表达。MVD计算：4倍光镜下选择3个CD105蛋白表达热区，于10倍光镜下计数CD105标记的微血管，取3个视野的均值作为MVD值[3,5]。

1.3 统计学处理

采用SPSS 19.0软件进行统计学分析，计数资料用例(%)表示，食管鳞癌组织和癌旁正常组织中的CD137LmRNA、CD137L蛋白阳性表达比较分别采用t检验和χ2检验。不同临床病理特征的食管鳞癌组织中CD137L蛋白阳性表达率比较采用χ2检验。两种组织中MVD比较采用t检验。采用Pearson法分析食管鳞癌组织中CD137LmRNA表达量与MVD的相关性，检验水准为α=0.05，P<0.05为有统计学差异。

2 结果

2.1 两种组织中CD137L mRNA和蛋白表达比较

采用qPCR法检测80例食管鳞癌组织和对应癌旁正常组织中的CD137LmRNA相对表达量，结果显示食管鳞癌组织中的CD137LmRNA相对表达量低于癌旁正常组织，差异有统计学意义(P<0.05)；免疫组织化学染色结果显示，食管鳞癌组织中CD137L蛋白主要表达在细胞膜，少量表达在细胞质，蛋白阳性表达率显著低于癌旁正常组织，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2和图1。

表2 两种组织中的CD137L mRNA和蛋白表达比较

图1 两种组织中的CD137L蛋白表达病理图 免疫组织化学染色SP法 ×400 A 食管鳞癌组织 B 癌旁正常组织

2.2 食管鳞癌组织中CD137L蛋白表达与临床病理特征的关系

如表3所示，浸润深度越深，则CD137L蛋白阳性表达率越低，有淋巴结转移患者的CD137L蛋白阳性表达率低于无淋巴结转移患者，差异均有统计学意义(P均<0.05)。

表3 食管鳞癌组织中CD137L蛋白表达与临床病理特征的关系

2.3 两种组织中MVD比较

采用CD105标记MVD，免疫组织化学法结果显示，CD105蛋白主要表达于血管内皮细胞，食管鳞癌组织中的MVD显著高于癌旁正常组织[(36.92±6.55)/mm2比(10.17±2.12)/mm2]，差异有统计学意义(t=10.002，P=0.000)。见图2。

图2 两种组织中CD105标记的MVD病理图 免疫组织化学染色SP法 ×400 A 食管鳞癌组织 B 癌旁正常组织

2.4 食管鳞癌组织中CD137L表达与MVD的相关性

比较食管鳞癌组织中CD137L蛋白阳性表达患者与阴性表达患者的MVD，结果显示前者的MVD显著低于后者[(31.94±6.13)/mm2比(41.77±6.08)/mm2]，差异有统计学意义(P<0.05)。采用Pearson法分析CD137LmRNA相对表达量与MVD的相关性，结果发现，CD137LmRNA相对表达量与MVD呈显著负相关(r=0.492，P=0.000)。

3 讨论

食管癌是临床上较为常见的恶性肿瘤，在中国，其发病率居恶性肿瘤第9位，病死率居恶性肿瘤第4位，恶性程度较高[9]。国外研究显示多数食管癌为腺癌[10]，而国内研究显示95%的食管癌为鳞癌[11]，国内外食管癌组织来源的不同可能与国内外人群遗传差异、饮食习惯不同等因素相关。虽然目前对食管癌患者采用以手术为主，辅以化学治疗、放射治疗、中药治疗及对症治疗等治疗方式，但其5年生存率仍低于40%[8,12]。近年来开展了针对性较强的免疫治疗，其机制为激活免疫调节分子增强机体的抗肿瘤反应。调节免疫反应的免疫因子又称为协同刺激分子[13-14]，相关研究表明CD28/B7均为重要的协同刺激分子，而CD137为目前较新的研究热点，CD137L为CD137的配体，表达于多数实体肿瘤细胞上，是一种Ⅱ型跨膜蛋白，多数学者认为肿瘤组织中CD137L低表达和不表达是肿瘤免疫逃逸的机制之一[15-17]。CD137与CD137L结合可刺激多条信号通路，激活免疫反应，参与多种肿瘤的发生，如非小细胞肺癌、胰腺癌、食管癌等[18-19]。然而，相关研究中均未对食管鳞癌中CD137L表达及其与肿瘤转移和MVD的相关性进行阐述。因此，本研究通过比较80例食管鳞癌患者的鳞癌组织和对应癌旁正常组织中CD137L、CD105表达并分析CD137L表达与MVD的相关性，旨在探讨CD137L表达对肿瘤转移及MVD的意义。

本研究采用qPCR法检测80例食管鳞癌及其对应癌旁正常组织中CD137LmRNA的相对表达量，结果发现食管鳞癌组织中CD137LmRNA的相对表达量显著低于癌旁正常组织；免疫组织化学结果显示，食管鳞癌组织中CD137L蛋白主要表达在细胞膜，少量表达在细胞质，可观察到黄色或棕黄色颗粒，CD137L蛋白阳性表达率显著低于癌旁正常组织，其分子机制不明。研究表明，细胞膜表面蛋白与免疫因子结合是引起免疫清除的重要因素，肿瘤细胞膜表面蛋白通常不表达或低表达，以逃逸免疫监视，在肿瘤发生、发展阶段具有重要意义[20]。本研究显示，食管鳞癌组织中CD137LmRNA和蛋白的表达均低于癌旁正常组织，与该研究结论相符。

本研究分析了食管鳞癌组织中CD137L蛋白表达与临床病理特征的关系，发现肿瘤浸润深度越深，CD137L蛋白阳性表达率越低，有淋巴结转移的患者的CD137L蛋白阳性表达率低于无淋巴结转移的患者，差异均有统计学意义(P均<0.05)。浸润程度较深、有淋巴结转移，提示患者肿瘤分期较高，预后较差。本研究中结果提示CD137L蛋白低表达患者的预后较差，生存率较低。因此，可将CD137L作为判断病情及预后的指标。

研究表明MVD是评估肿瘤内微血管形成的重要指标。本研究中免疫组织化学结果显示，CD105蛋白主要表达于血管内皮细胞，食管鳞癌组织中MVD显著高于癌旁正常组织(t=10.002，P=0.000)。肿瘤内血管形成对于肿瘤的发生、发展及转移具有重要意义。通常血管的丰富程度反映了肿瘤的发展速度，且血供越丰富，则肿瘤经血液及淋巴转移的可能性越大。因此，MVD也可作为判断肿瘤患者预后的重要指标。研究表明，MVD升高提示肿瘤内新生血管增多，尤其是转移的淋巴结组织中血管增多，血供增加，肿瘤侵袭能力增强，导致患者预后不良[21]。

CD137L表达越低预示肿瘤恶性程度越高，患者预后越差；MVD越高预示肿瘤侵袭能力越强，患者预后越差。本研究分析了食管鳞癌组织中CD137L表达与MVD的相关性，结果显示CD137L蛋白阳性表达患者的MVD显著低于CD137L蛋白阴性表达患者(P<0.05)。采用Pearson法分析CD137LmRNA相对表达量与MVD的相关性，结果发现，CD137L mRNA相对表达量与MVD呈显著负相关(r=0.492，P=0.000)。机体免疫监视的强度、肿瘤血供的丰富程度均为肿瘤发展、转移的重要评价指标。CD137L表达与免疫监视的强度相关，MVD是肿瘤微血管形成的评价指标。研究表明CD137与CD137L结合后具有活化、刺激、趋向、增强T细胞的作用[15,20]。因此，CD137L蛋白阳性与阴性表达患者的肿瘤MVD存在差异，且CD137LmRNA低表达、MVD高表达的患者预后不良。

综上所述，食管鳞癌组织中CD137L主要表达在细胞膜，少量表达在细胞质。CD137L在食管鳞癌组织中呈低表达，与肿瘤转移及MVD密切相关，可为临床免疫治疗研究、食管肿瘤进展机制研究提供理论基础。