miR-23a/SATB2信号通路对结直肠癌SW480细胞凋亡和转移的影响

高永涛 白 浪 樊 华 刘 涛 姬 乐 雷 星 邓世波 袁江涛

结直肠癌(CRC)的进展和转移与肿瘤细胞的恶性生长、转移及凋亡减少有关，并且这些肿瘤细胞的生物学特性与基因调控有关，通过研究基因调控肿瘤细胞功能探讨肿瘤发生机制，对于分子靶向治疗肿瘤具有重要意义[1]。miRNA在疾病发生中发挥着重要作用，目前已知miRNA在心血管系统疾病、缺氧损伤中扮演着关键角色，miRNA还可作为疾病治疗的靶点[2]。miR-23a参与了细胞发育过程中的不同阶段，如细胞增殖、变异、凋亡等，对于骨骼肌和神经的发育起着重要作用[3-4]。近年来的研究表明，miR-23a与人类肿瘤关系密切，在许多肿瘤(胶质瘤、口腔鳞癌、胰腺癌)中发挥着促癌作用，靶向下调miR-23a的表达可抑制肿瘤的进展和转移[5-7]。既往研究显示，miR-23a在CRC组织中表达上调，并且具有促进CRC细胞增殖的作用[8]。目前对于miR-23a在CRC细胞凋亡及转移中的作用和调控机制尚不清楚，本研究以CRC SW480细胞作为实验对象，探讨在体外下调miR-23a表达对CRC细胞恶性表型的作用，为寻找有效的CRC分子治疗靶点提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

CRC SW480细胞购自微蒙生物科技(上海)有限公司；兔多抗[剪切的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3(C-Caspase-3)抗体]、特殊富含AT序列结合蛋白2(SATB2)抗体购自美国Abcam公司；miR-23a抑制剂(inhibitor)、inhibitor对照(control)由吉满生物科技(上海)有限公司合成；Lipofectamine 2000转染试剂购自美国Invitrogen公司；基质金属蛋白酶-2(MMP-2)抗体购自美国Santa Cruz公司；荧光素酶报告载体由江苏凯基生物技术股份有限公司合成；miR-23a模拟物(mimics)和mimics control由苏州吉玛基因股份有限公司合成；CCK-8增殖检测试剂盒购自杭州联科生物技术股份有限公司；SATB2小干扰RNA(siRNA)、siRNA control由上海美轩生物科技有限公司合成。

1.2 细胞转染

当SW480细胞汇合度约为40%时，采用Lipofectamine 2000试剂进行细胞转染，操作步骤按照转染试剂说明书进行。将转染miR-23a inhibitor、inhibitor control后的 SW480细胞记为Anti-miR-23a、Anti-NC，将没有转染的细胞记为对照(Control)。

1.3 定量RT-PCR法检测miR-23a表达

取培养48 h后的Control、Anti-NC、Anti-miR-23a细胞，添加TRIzol试剂，提取细胞中的总RNA。使用反转录试剂盒合成cDNA，cDNA保存在-20 ℃冰箱。定量RT-PCR(qRT-PCR)反应体系如下：12.5 μL SYBR Green Realtime PCR Master Mix、1 μL上游引物、1 μL下游引物、2.5 μL cDNA，添加RNAse free水至25 μL。qRT-PCR反应程序为：95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 10 s，40个循环。内参为U6，按照2-△△Ct法计算miR-23a mRNA的相对表达量。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.4 CCK-8法检测细胞增殖

将转染后的Control、Anti-NC、Anti-miR-23a细胞接种到96孔板中，每个孔内加100 μL细胞悬浮液，置于37 ℃培养箱中培养48 h后，取出培养板，添加10 μL CCK-8溶液，置于避光条件下孵育4 h。在酶标仪上测定OD值，波长为450 nm。

1.5 平板克隆法检测细胞克隆能力

将转染后的Control、Anti-NC、Anti-miR-23a细胞接种到6孔板中，每个孔内添加1 000个细胞，添加2 mL的细胞培养液，培养13 d后，在显微镜下可观察到细胞团形成。用PBS洗涤细胞团，添加0.1%结晶紫工作液将细胞染色，在显微镜下观察超过50个细胞的克隆形成数目。

1.6 流式细胞术测定细胞凋亡

取培养48 h后的Control、Anti-NC、Anti-miR-23a细胞，用PBS洗涤后，每组收集约1×106个细胞，用PBS溶液悬浮洗涤后，添加250 μL结合缓冲液重悬细胞，过400目网筛，添加5 μL Annexin V-FITC溶液染色后，混合均匀，在避光条件下孵育20 min。添加PI染色液10 μL，混合均匀，在避光条件下孵育5 min。置于流式细胞仪上检测细胞凋亡的变化。

1.7 Transwell小室检测细胞侵袭和迁移

按1∶10稀释基质胶，吸取60 μL添加至Transwell小室的上室中，2 h后观察基质胶已变成凝胶状。取Control、Anti-NC、Anti-miR-23a细胞，用不含血清的培养液将细胞悬浮并添加300 μL到小室的上室中，细胞密度为5×105/L。在下室中添加500 μL含有血清的细胞培养液，置于37 ℃中孵育培养48 h。取出小室，用甲醇固定，结晶紫染色以后，在显微镜下观察穿膜细胞数量即为细胞侵袭数量。细胞迁移步骤同上，省去基质胶湿化步骤。

1.8 蛋白质印迹法检测MMP-2、C-Caspase-3蛋白的表达水平

取培养48 h以后的Control、Anti-NC、Anti-miR-23a细胞，分别添加细胞裂解溶液，混合均匀，置于冰上反应30 min，以12 000 r/min离心10 min，吸取蛋白溶液，加入到Loading Buffer中混合，煮沸反应5 min。配置10%分离胶和6%浓缩胶，每个孔内添加40 μg蛋白，打开电源，将电压调整为80 V，当样品马上进入分离胶时，将电压调整为100 V，电泳约1.5 h后，进行转膜。转膜在冰上进行，200 mA电流，将蛋白从凝胶上转移到NC膜。NC膜置于5%牛血清白蛋白中，室温孵育90 min，然后置于一抗孵育液中，室温孵育2 h，最后置于二抗孵育液中，室温孵育1.5 h。二抗按1∶4 000稀释，MMP-2、C-Caspase-3抗体分别按1∶1 000和1∶600稀释。滴加ECL发光试剂，以GAPDH为参照，分析蛋白表达变化。

1.9 miR-23a靶基因预测和鉴定

利用生物信息学软件targetscan在线预测miR-23a的靶基因，发现SATB2的3′端非编码区(3′UTR)与miR-23a有互补结合位点，构建含有SATB2的3′UTR的野生型荧光素酶报告载体(WT)和突变型荧光素酶报告载体(MUT)，将WT和MUT分别与miR-23a mimics和mimics control共转染至SW480细胞中，48 h后用荧光素酶活性检测试剂盒检测荧光素酶活性变化。

1.10 SATB2 siRNA对下调miR-23a表达影响SW480细胞增殖、克隆、凋亡、侵袭和迁移的逆转作用

在SW480细胞中分别共转染miR-23a inhibitor、siRNA control和miR-23a inhibitor、SATB2 siRNA，记为Anti-miR-23a+si-NC、Anti-miR-23a+si-SATB2。采用上述CCK-8、平板克隆实验、流式细胞术、Transwell小室、Western blot方法检测细胞增殖、克隆、凋亡、侵袭和迁移，以及SATB2、MMP-2、C-Caspase-3蛋白表达水平。

1.11 统计学分析

2 结果

2.1 miR-23a inhibitor转染对SW480细胞中miR-23a mRNA表达的影响

如表1所示，与Anti-NC组相比，SW480细胞中转染miR-23a inhibitor后，Anti-miR-23a组细胞中的miR-23a mRNA相对表达量降低，差异有统计学意义(P<0.05)。结果表明miR-23a inhibitor可抑制SW480细胞中miR-23a mRNA的表达。

表1 各组细胞中miR-23a mRNA相对表达量的比较()

2.2 miR-23a inhibitor转染对SW480细胞增殖、克隆、凋亡的影响

与Anti-NC组相比，SW480细胞中转染miR-23a inhibitor后，Anti-miR-23a组细胞的OD值降低，克隆形成数量减少，细胞凋亡率升高，细胞中C-Caspase-3蛋白表达水平升高，差异均有统计学意义(P均<0.05)，见图1、表2。结果表明miR-23a inhibitor可抑制SW480细胞的增殖、克隆，并可诱导凋亡。

图1 各组SW480细胞的凋亡和C-Caspase-3蛋白表达水平比较 A 流式细胞术检测各组SW480细胞的凋亡 B 蛋白质印迹法检测各组SW480细胞中C-Caspase-3蛋白的表达水平

表2 各组SW480细胞的OD值、克隆形成数量、凋亡率及C-Caspase-3蛋白表达水平比较()

2.3 miR-23a inhibitor转染对SW480细胞侵袭和迁移的影响

与Anti-NC组相比，SW480细胞中转染miR-23a inhibitor后，Anti-miR-23a组细胞的侵袭和迁移数量减少，细胞中MMP-2蛋白表达水平降低，差异均有统计学意义(P均<0.05)，见图2、表3。结果表明miR-23a inhibitor可抑制SW480细胞的侵袭和迁移。

图2 蛋白质印迹法检测各组SW480细胞中MMP-2蛋白表达水平

表3 各组SW480细胞的迁移、侵袭数量及MMP-2蛋白表达水平比较()

2.4 miR-23a对SATB2表达的调控

靶基因预测软件发现，miR-23a与SATB2的3′UTR有互补结合位点，与mimics control组相比，miR-23a mimics共转染后的WT SW480细胞荧光素酶活性降低(P<0.05)。与Anti-NC组相比，SW480细胞中转染miR-23a inhibitor后，Anti-miR-23a组细胞的SATB2蛋白表达水平升高，差异有统计学意义(P<0.05)。结果表明miR-23a可靶向负调控SATB2的表达。见图3、表4、表5。

表4 两组荧光素酶活性比较()

表5 两组SW480细胞中SATB2蛋白的表达水平比较()

图3 miR-23a靶基因预测 A miR-23a与SATB2的3′UTR互补结合位点 B 蛋白质印迹法检测两组SW480细胞中SATB2蛋白的表达水平

2.5 SATB2 siRNA对下调miR-23a影响SW480细胞增殖、克隆、凋亡和侵袭迁移的逆转作用

与Anti-miR-23a+si-NC组相比，SW480细胞中共转染SATB2 siRNA和miR-23a inhibitor后，Anti-miR-23a+si-SATB2组细胞的增殖、克隆、侵袭、迁移能力均增强，MMP-2蛋白表达水平升高，细胞凋亡率和C-Caspase-3蛋白表达水平均降低，SATB2蛋白表达水平下降，差异均有统计学意义(P均<0.05)，见图4、表6。结果表明SATB2 siRNA可逆转下调miR-23a表达对SW480细胞增殖、克隆、侵袭、迁移的抑制作用及诱导凋亡作用。

图4 两组SW480细胞的凋亡和C-Caspase-3、MMP-2、SATB2蛋白表达水平比较 A 流式细胞术检测两组SW480细胞的凋亡 B 蛋白质印迹法检测两组SW480细胞中C-Caspase-3、MMP-2、SATB2蛋白的表达水平

表6 两组SW480细胞的OD值、凋亡率、克隆形成、迁移、侵袭数量及C-Caspase-3、MMP-2、SATB2蛋白表达水平比较()

3 讨论

miRNA在人类肿瘤中具有十分重要的意义，一些miRNA分子在肿瘤中表达异常，可能是肿瘤诊断的标志物，还有一些miRNA的表达异常与肿瘤的发生及转移有关[9]。miR-23a是近年来发现的与肿瘤有关的调控分子，对于肿瘤的进展具有重要意义[10]。既往研究发现，miR-23a参与了细胞的生长和分化，对于组织炎性反应、细胞代谢具有调节作用[11]。miR-23a在神经系统肿瘤中高表达，并可正向调控肿瘤细胞的侵袭和迁移[12]。在B细胞淋巴瘤、乳腺癌等组织中也发现miR-23a呈高表达[13-14]。CRC相关研究显示，miR-23a在肿瘤组织和细胞中表达上调，与肿瘤的临床分期和浸润有关[8]。本研究结果显示，下调miR-23a后的CRC细胞的增殖、克隆、侵袭和迁移能力下降，细胞凋亡增多，提示下调miR-23a具有抵抗CRC细胞恶性表型的作用，miR-23a在CRC细胞恶性进展中可能发挥了促进作用。

细胞外基质降解是肿瘤细胞向远处组织转移和浸润的基础，而MMP是细胞外基质降解的关键酶，其有多个家族成员，分别可以降解细胞外基质中的不同组分[15]。MMP-2与肿瘤转移密切相关，是肿瘤细胞转移能力的标志物[16]。Caspase是在人体组织中存在的蛋白家族，参与了几乎所有细胞的凋亡过程，也是迄今为止发现的与细胞凋亡关系较为密切的蛋白家族[17]。Caspase-3是Caspase家族的凋亡执行因子，其活化后可促进细胞凋亡的发生，正常状态下以无活性的酶原形式存在[18]。本研究结果显示，下调miR-23a后，CRC细胞中的C-Caspase-3蛋白表达水平升高，MMP-2蛋白表达水平降低，这说明下调miR-23a能够抑制CRC细胞的侵袭并诱导细胞凋亡发生。

miRNA是一类非编码的RNA，能通过与靶mRNA的3′UTR互补结合，从而影响靶基因的翻译，并且同一个miRNA分子可有多个靶基因，参与不同的组织生理、病理过程[19]。本研究发现，miR-23a可靶向负调控SATB2的表达，miR-23a的作用机制可能与SATB2有关。既往研究显示，SATB2是一个在CRC组织和细胞中表达下调的抑癌基因，其可抑制肿瘤细胞的生长和转移[20-21]。本研究表明，下调SATB2表达可逆转下调miR-23a表达对CRC细胞增殖、克隆、侵袭和迁移的抑制及对凋亡的促进，说明下调miR-23a调控CRC细胞恶性表型与靶向SATB2有关。

总之，miR-23a在CRC进展中可能发挥了促癌基因的作用，下调其表达可通过靶向上调SATB2抑制CRC细胞增殖、克隆、侵袭和迁移，诱导细胞凋亡发生，这为研究miR-23a在CRC中的作用机制提供了参考，为分子靶向治疗CRC提供了新思路。本研究仅在SW480细胞中进行了初步探讨，今后的研究将在多种CRC细胞株和体内进行验证。