腺病毒介导NAMPT过表达对酒精性脂肪性肝病大鼠的作用及机制研究

周 萌 段超勤 陈志荣

酒精性脂肪性肝病(AFLD)是指由于长期大量饮酒导致的以肝细胞脂肪性病变为主的一类疾病。近年来，随着中国社会经济的发展，生活方式和饮食习惯发生了巨大改变，由酒精性肝损伤发展而来的酒精性肝病的发病率呈逐年升高趋势，AFLD为酒精性肝病的早期阶段，对其开展研究十分必要[1-2]。NF-κB是参与炎性反应和免疫应答的重要因子，抑制其表达可改善由乙醇诱导的肝损伤[3]。烟酰胺磷酸核糖转移酶(NAMPT)在人体的肝脏、骨骼和肌肉组织中广泛表达，在细胞的代谢、凋亡方面具有重要作用[4-5]。有研究发现NAMPT可下调NF-κB表达，从而抑制炎性反应[6-7]。由此推测，NAMPT可能通过抑制NF-κB介导的炎性反应，从而改善AFLD。本文探究了NAMPT对AFLD的影响及作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

本研究选取45只SPF级SD雄性大鼠，体质量为180～220 g，由中国医科大学动物实验中心提供，许可证号：SYXK(辽)2018-0014，保持室温为(25±2)℃，相对湿度为(55±10)%，12 h的昼、夜循环，适应性饲养1周。

1.2 动物模型与分组

45只大鼠适应性饲养1周后，随机抽取10只作为空白组，给予0.9%氯化钠溶液，进食普通饲料，持续8周。其余35只大鼠给予乙醇灌胃，采用每3天升高乙醇5%体积分数的方式逐渐从30%增高至55%，同时进食高脂饲料。造模21 d后，随机抽取5只大鼠，采用H-E染色和油红O染色观察大鼠肝脏病理变化，判断AFLD大鼠模型是否构建成功。然后将造模成功的30只大鼠随机分为模型组、空载体组、过表达NAMPT组，每组10只。其中空载体组大鼠在第1、5周于尾静脉注射200 μL Ubi-EGFP(空载体)，过表达NAMPT组大鼠在第1、5周于尾静脉注射200 μL NAMPT慢病毒载体[8-9]。采用实时荧光定量PCR(real-time qPCR)法判断NAMPT是否成功过表达。

1.3 血清学指标检测

第8周末，各组大鼠禁食不禁水12 h后，摘眼球取血，分离血清，测定肝脏质量，然后取肝组织进行组织匀浆。肝脏指数=肝脏质量/体质量×100%。使用全自动生化分析仪检测血清中ALT、AST水平，试剂盒均购自美国Bio-Swamp公司。

1.4 肝脏组织病理变化

采用H-E染色法观察大鼠肝脏组织病理变化，采用油红O染色法观察大鼠肝脏组织脂肪沉积情况。将固定于4%多聚甲醛溶液中的肝脏组织取出，石蜡包埋切片，之后进行H-E染色和油红O染色，观察切片。

1.5 肝脏组织中mRNA相对表达量检测

采用real-time qPCR法检测各组大鼠肝脏组织中NAMPTmRNA、NF-κBmRNA、TNF-αmRNA相对表达量。取大鼠肝脏组织，液氮研磨后加入适量的TRIzol试剂提取RNA，使用PrimeScriptTMRT试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)进行反转录，使用PCR扩增仪(美国Bio-Rad公司)进行扩增。采用2-ΔΔCt法计算目的RNA的相对表达量，以β-actin作为内参。引物由沈阳鼎国生物技术有限公司设计，引物序列详见表1。

表1 引物序列

1.6 肝脏组织中NF-κB、TNF-α蛋白水平检测

采用蛋白质印迹法检测各组大鼠肝脏组织中NF-κB、TNF-α蛋白水平。使用裂解液提取组织总蛋白，利用BCA试剂盒检测蛋白浓度，然后加入适量的上样缓冲液，沸水浴变性，进行电泳。电泳完毕后转到PVDF膜上。兔源抗NF-κB、TNF-α单克隆抗体(上海碧云天生物技术有限公司，1∶500)4 ℃孵育过夜，二抗为山羊抗兔IgG抗体(上海碧云天生物技术有限公司，1∶2 000)，ECL显色。应用Image-pro plus 6.0软件计算半定量蛋白条带的灰度值，分析蛋白的相对表达情况。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 各组大鼠的一般体征和肝脏指数比较

空白组大鼠的皮毛光滑，行动活跃，体质量增长较快。造模各组大鼠皮毛暗淡，活动减少，对外界刺激反应迟钝，造模后2周内食欲减退，体质量降低，随后呈缓慢增长趋势。与空白组比较，模型组、空载体组和过表达NAMPT组的肝脏质量、肝脏指数均较高，差异均有统计学意义(P均<0.05)；与模型组和空载体组比较，过表达NAMPT组的肝脏质量、肝脏指数均较低，差异均有统计学意义(P均<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠的肝脏质量和肝脏指数比较

2.2 各组大鼠血清中ALT、AST的表达水平比较

与空白组比较，模型组、空载体组和过表达NAMPT组血清中ALT、AST表达水平均较高，差异均有统计学意义(P均<0.05)。与模型组和空载体组比较，过表达NAMPT组血清中ALT、AST表达水平均较低，差异均有统计学意义(P均<0.05)。见表3。

表3 各组大鼠血清中ALT、AST的表达水平比较

2.3 各组大鼠肝脏组织的病理变化

光学显微镜下可见，空白组大鼠肝脏组织中，各层结构完整，组织连续、排列规则，无明显脂质沉积；模型组和空载体组大鼠的肝脏各层结构有不同程度的破坏，组织与腺体形态不规则、排列紊乱，可见炎性细胞浸润，有大量脂质沉积；与空白组比较，过表达NAMPT组大鼠病理变化不明显，表现为肝脏各层有些许愈合，排列相对整齐，仅可见少量的炎性细胞浸润和脂质沉积。见图1、图2。

图1 各组大鼠肝脏组织病理图像 H-E染色 ×400 A 空白组 B 模型组 C 空载体组 D 过表达NAMPT组

图2 各组大鼠肝脏组织病理图像 油红O染色 ×400 A 空白组 B 模型组 C 空载体组 D 过表达NAMPT组

2.4 各组大鼠肝脏组织中NAMPT mRNA、NF-κB mRNA、TNF-α mRNA相对表达量比较

与空白组比较，模型组和空载体组肝脏组织中NAMPTmRNA相对表达量较低，NF-κBmRNA和TNF-αmRNA相对表达量较高，差异均有统计学意义(P均<0.05)。与模型组和空载体组比较，过表达NAMPT组肝脏组织中NAMPTmRNA相对表达量较高，NF-κBmRNA和TNF-αmRNA相对表达量较低，差异均有统计学意义(P均<0.05)。见表4。

表4 各组大鼠肝脏组织中NAMPT mRNA、NF-κB mRNA、TNF-α mRNA水平比较

2.5 各组大鼠肝脏组织中NF-κB、TNF-α蛋白表达水平比较

与空白组比较，模型组、空载体组肝脏组织中NF-κB、TNF-α蛋白相对表达量均较高，过表达NAMPT组肝脏组织中NF-κB蛋白相对表达量较高，差异均有统计学意义(P均<0.05)。与模型组和空载体组比较，过表达NAMPT组肝脏组织中NF-κB、TNF-α蛋白相对表达量均较低，差异均有统计学意义(P均<0.05)。见图3、表5。

图3 各组大鼠肝脏组织中NF-κB、TNF-α的蛋白质印迹图 A 空白组 B 模型组 C 空载体组 D 过表达NAMPT组

表5 各组大鼠肝脏组织中NF-κB、TNF-α蛋白水平比较

3 讨论

AFLD是酒精性肝病的早期阶段，主要是由于乙醇和代谢产生的氧化物通过多种途径直接或间接损伤肝脏所致[10-11]。本研究采用乙醇灌胃并给予进食高脂饲料的方式构建AFLD大鼠模型，通过观察大鼠症状、体征、肝脏指数及病理切片可知，AFLD模型构建成功。real-time qPCR法检测结果可知，过表达NAMPT组肝脏组织中NAMPTmRNA相对表达量高于模型组和空载体组，这提示NAMPT过表达造模成功。本研究结果表明，与模型组和空载体组比较，过表达NAMPT组大鼠的肝脏指数降低，肝脏病理损伤明显减轻，这提示过表达NAMPT有助于改善AFLD。

NAMPT作为内脏脂肪素，可以抑制多种炎性因子表达，参与机体炎性反应和代谢紊乱[12-13]。NAMPT可调控细胞内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸水平，并通过调控单核细胞/巨噬细胞的分化、极化和迁移等参与炎症性肠病的发生和发展[14]。此外，研究表明NAMPT可通过促进基质金属蛋白酶-3(MMP-3)、MMP-12和MMP-13的表达参与骨关节炎的发生[15]。另有研究表明，抑制NAMPT表达会靶向沉默信息调节因子1/MAPKα/固醇调节元件结合蛋白1信号转导通路，加重由高脂饲养诱导的小鼠肝脏脂肪变性[16]。

NF-κB在调控人体炎性反应中扮演着重要角色[17]。研究表明，炎性反应、自身免疫性疾病、感染性休克、病毒感染等均与NF-κB的调控失衡有关，且NF-κB激活的同时会促使TNF-α表达升高[18-20]。本研究通过检测各组大鼠肝脏组织中NF-κB、TNF-α的mRNA及蛋白表达水平，结果显示与空白组比较，模型组、空载体组和过表达NAMPT组NF-κBmRNA及蛋白、TNF-αmRNA的相对表达量均较高；与模型组和空载体组比较，过表达NAMPT组NF-κB和TNF-α的mRNA及蛋白的相对表达量均较低。以上结果提示，过表达NAMPT可下调NF-κB和TNF-α的水平，从而抑制炎性反应。

综上所述，过表达NAMPT可抑制AFLD大鼠的炎性反应，其机制可能与下调NF-κB、TNF-α的表达水平有关。因此，NAMPT有望成为临床治疗AFLD的新靶点，展现出了具有前景的应用价值。