原发性肝癌组织中miR-557的表达及其与预后的关系

陈绪林 姜 宇 赵 艳 李彩华 高逸之

原发性肝癌(PLC)是一种常见的恶性肿瘤[1]。在中国PLC的发病率和病死率均较高，严重威胁着人们的健康和生命安全[2]。探究PLC的发病机制，寻找准确度较高的生物标志物以评估PLC的预后具有重要意义。miRNA是一类由18～24个核苷酸组成的不具备编码蛋白质功能的单链RNA，可参与PLC的发病及进展过程[3-5]。研究表明，miR-557参与了胰腺癌[6]、乳腺癌[7]、肺癌[8]等的发生和发展，但目前有关miR-557与PLC关系的报道较少。有研究发现，miR-557可通过靶向抑制促红细胞生成素肝细胞激酶受体膜结合配体B2(EphrinB2)，抑制胰腺导管腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭[9]。另有研究表明，EphrinB2与PLC的发生、发展密切相关[10-11]。由此推测，miR-557可能通过靶向EphrinB2参与了PLC的发病及进展。本文通过检测miR-557在PLC组织中的表达水平，探究其与患者预后的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

前瞻性选取2015年4月至2017年6月在秭归县人民医院就诊的114例PLC患者作为研究对象。参照《原发性肝癌规范化病理诊断指南(2015年版)》[12]诊断PLC。纳入标准：(1)经病理检查确诊为PLC；(2)年龄>18岁；(3)具有保存完好的PLC组织及癌旁组织(距离肿瘤边缘>2 cm)标本；(4)能够配合完成相关检查；(5)签署了知情同意书。排除标准：(1)就诊前曾接受放射治疗、化学治疗；(2)合并其他恶性肿瘤；(3)Child-Pugh分级C级；(4)随访失联；(5)肾病综合征或肾移植患者。114例PLC患者中男性76例，女性38例，年龄48～70岁，平均年龄为(61.78±4.61)岁。本研究经医院医学伦理委员会批准(批件号：201502003)。

1.2 信息收集

收集所有入组受试者的年龄、性别、Child-Pugh分级、乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、甲胎蛋白(AFP)、肿瘤直径、肿瘤数量、肿瘤分期及治疗方案等信息。于患者出院后1个月开始随访，采用电话随访或复诊方式了解PLC患者的预后生存情况，每3个月随访1次，为期3年，末次随访时间为2020年6月6日。

1.3 miR-557表达水平检测

采用实时荧光定量PCR法检测组织中miR-557的表达水平。具体步骤：无菌环境下剪碎组织、研磨，取研磨液，4 000 r/min离心15 min，离心后提取上层清液；采用TRIzol法提取总RNA，运用紫外分光光度计检测其纯度；使用反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA；使用PCR仪进行扩增反应，反应条件为94 ℃预变性5 min，之后94 ℃ 30 s，60 ℃ 35 s，72 ℃ 35 s，共计35个循环。以GAPDH为内参，ΔCt=CtmiR-557-CtGAPDH，采用2-ΔΔCt计算miR-557的相对表达量。引物由上海吉玛制药技术有限公司设计，序列见表1。

表1 引物序列

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 PLC患者组织中miR-557的表达水平

miR-557在PLC组织中的相对表达量为0.81±0.14，低于癌旁组织(1.16±0.11)，两组的差异有统计学意义(t=19.756，P<0.001)。

2.2 PLC组织中miR-557的表达与患者临床病理特征的关系

如表2所示，miR-557在不同年龄、性别、Child-Pugh分级、HBsAg、AFP水平及肿瘤数量的患者PLC组织中表达水平的差异均无统计学意义(P均>0.05)。miR-557在肿瘤直径>5 cm、肿瘤分期为Ⅲ～Ⅳ期的患者PLC组织中的表达水平分别低于肿瘤直径≤5 cm、肿瘤分期为Ⅰ～Ⅱ期的患者，差异均有统计学意义(P均<0.05)。

表2 PLC组织中miR-557的表达与患者临床病理特征的关系

2.3 患者生存情况

114例PLC患者在随访3年后有38例死亡，患者的3年生存率为66.67%(76/114)。根据患者预后生存情况将患者分为生存组(n=76)和死亡组(n=38)。生存组PLC组织中miR-557的相对表达量为0.87±0.12，高于死亡组(0.71±0.11)，差异有统计学意义(t=6.507，P<0.001)。miR-557预测PLC患者预后生存的ROC曲线下面积(AUC)、最佳截断值、敏感度和特异度分别为0.824(95%CI：0.741～0.889)、0.79、76.32%和73.68%，见图1。以miR-557评估PLC患者预后生存的最佳截断值为分界点，将PLC患者分为miR-557高表达组(n=68)和miR-557低表达组(n=46)。miR-557高表达组的中位生存时间为36个月，长于miR-557低表达组(23个月)，差异有统计学意义(log-rankχ2=25.688，P<0.001)，见图2。

图1 PLC组织中miR-557预测PLC患者预后生存的ROC曲线

图2 miR-557高表达组和低表达组的生存情况

2.4 影响PLC患者预后生存的相关因素

将可能与PLC患者预后有关的因素如年龄、性别、Child-Pugh分级、HBsAg、AFP、肿瘤数量、肿瘤直径、肿瘤分期、治疗方案及miR-557作为自变量，将PLC患者的预后生存情况作为因变量，纳入Cox单因素回归分析，结果显示Child-Pugh分级、肿瘤直径、肿瘤分期及miR-557与PLC患者预后生存有关(P<0.05)。将Child-Pugh分级、肿瘤直径、肿瘤分期及miR-557作为自变量，将PLC患者的预后生存情况作为因变量，纳入Cox多因素回归分析，结果显示肿瘤直径和肿瘤分期是PLC患者预后的独立危险因素(P<0.05)，miR-557是PLC患者预后的独立保护因素(P<0.05)，见表3。

表3 影响PLC患者预后的单因素和多因素Cox比例风险回归分析

3 讨论

大多数PLC患者在确诊时已属于晚期，失去了最佳治疗时机，预后较差。因此，尽早确诊并积极治疗是改善PLC患者预后的关键[13]。鉴于此，探究PLC的发病机制，寻找预后评估效能较高的生物标志物具有重要意义。本研究结果表明，PLC组织中miR-557的表达水平低于癌旁组织，提示miR-557可能参与了PLC的发病。本研究进一步分析了PLC组织中miR-557的表达与患者临床病理特征的关系，结果显示miR-557在肿瘤直径>5 cm、肿瘤分期为Ⅲ～Ⅳ期的患者PLC组织中的表达水平分别低于肿瘤直径≤5 cm、肿瘤分期为Ⅰ～Ⅱ期的患者。这提示miR-557的表达与PLC患者的肿瘤直径及肿瘤分期有关，其病理、生理机制有待进一步研究证实。

本研究结果显示，PLC患者的3年生存率为66.67%，与王钢等[14]的研究结果相近。本研究比较了生存组与死亡组PLC组织中miR-557的表达水平，结果显示生存组miR-557的表达水平高于死亡组，这提示miR-557可能与PLC患者的预后有关，其表达水平或可反映预后生存情况。方旭东等[15]研究显示，中性粒细胞/淋巴细胞比值、血小板/淋巴细胞比值预测PLC患者预后的AUC分别为0.625和0.678，表明其预测效能较低。本研究结果显示，miR-557预测PLC患者预后的AUC、敏感度和特异度分别为0.824、76.32%和73.68%，这提示miR-557预测PLC患者预后的效能较高，但敏感度和特异度偏低，其可作为辅助评估手段。

为进一步阐明miR-557与PLC患者预后的关系，本文比较了miR-557高表达组与低表达组的生存情况，结果显示miR-557高表达组的中位生存时间长于miR-557低表达组，这提示miR-557与PLC患者预后生存时间有关。既往研究表明，肿瘤直径、肿瘤分期与PLC患者预后密切相关[16-19]。为避免混杂因素影响分析结果，本文采用Cox比例风险回归模型分析影响PLC患者预后的相关因素，结果显示肿瘤直径和肿瘤分期是PLC患者预后的独立危险因素，与上述研究结果一致。此外，本研究结果还指出miR-557是PLC患者预后的独立保护因素，推测其原因可能是miR-557高表达可抑制EphrinB2表达，进而抑制PLC细胞增殖、迁移和侵袭，从而反映PLC患者的预后情况。

本研究尚存在一定不足，如为单中心研究、纳入研究的样本量偏小等，此外，在样本的选择上也存在一定偏倚，下一步将开展大样本、多中心研究。综上所述，miR-557在PLC组织中低表达，且与肿瘤直径和肿瘤分期有关。检测PLC组织中miR-557的表达水平有助于评估患者的预后生存情况，其表达水平越低，提示患者的预后生存率越低、生存时间越短。