丛枝菌根真菌对灌浆前期玉米子粒氮代谢及产量和品质的影响

张学林，吴梅，李晓立，何堂庆，张晨曦，田明慧，陈冰洁，张富粮，郝晓峰，杨青华

(河南农业大学农学院，河南 郑州 450002)

玉米(ZeamaysL.)是重要的粮食、经济、饲料作物，在中国粮食安全方面具有着重要作用。玉米灌浆期子粒氮代谢强弱对其生长发育、氮素转运及源供应能力的维持具有重要影响[1-3]。玉米子粒灌浆期氮代谢过程受到外界环境和栽培措施的影响[2-3]。周卫霞等[2]分析了弱光胁迫对不同基因型玉米子粒发育和氮代谢的影响；吕丽华等[4]认为，高种植密度下玉米子粒氮素代谢较为旺盛；李洪岐等[5]发现，高密度、宽窄行种植有利于玉米子粒碳氮代谢，保证子粒正常能源供应；苌建峰等[3]认为，高产田过量施肥不利于氮素向子粒转运，而中产田适当施肥能够协调灌浆子粒和营养器官间竞争氮素的矛盾。玉米子粒不同发育阶段对氮素的吸收量不同，其中抽雄前10 d至抽雄后25～30 d是玉米吸收氮素最多的时期，吸氮量占总氮量的70%左右[6]。夏光利等[7]也认为，玉米子粒硝酸还原酶、谷氨酸脱氢酶、谷氨酰胺合成酶和谷氨酸合成酶活性最大值均出现在授粉后20 d。明确玉米子粒氮素吸收高峰期的氮代谢特征，对改善氮素吸收利用和提高产量至关重要。

丛枝菌根真菌(ArbuscularmycorrhizaeFungi,AMF)是土壤中生物量最大的一类真菌，能与陆地上绝大多数的维管束植物形成共生体[8]，具有改善寄主根际土壤环境、促进养分吸收、增加生物量、提高寄主应对生物及非生物胁迫的能力[9-12]。研究发现，AMF显著提高玉米根系活力和吸收能力，改善其矿质营养和水分状况，增加叶片光合速率，促进生长发育[13-15]。REN等[13]研究认为，干旱条件下玉米接种AMF能够降低玉米叶片脱落酸含量，提高根系吸水率，增强其抗旱性，增加玉米生物量。同一种作物根系可以与多种不同的AMF形成共生关系，而不同AMF对同一种作物的影响效果也不同，AMF和宿主作物之间相互选择，成为该植物的优势种[14-15]。姜德峰等[14]和任禛等[15]比较了不同种丛枝菌根对玉米生理特性及子粒产量的影响，并筛选了适合玉米接种的 AMF 菌种。目前，关于丛枝菌根真菌影响玉米子粒氮代谢，尤其是灌浆高峰前期氮代谢的研究鲜有报道。不同AMF在玉米子粒氮代谢方面的差异性也不清楚。本研究选择在夏玉米灌浆前期进行试验，探究不同AMF在子粒氮代谢过程中的作用，为筛选对玉米生长有益的优势种，改善玉米养分吸收和生物肥料配施提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验地点和试验材料

2019年6—10月在河南省西平县二郎乡张尧村(114°02′E，33°20′N，平均海拔49 m)室外开展盆栽试验，土壤质地为砂姜黑土。供试土壤取自长期定位试验不施肥处理0～20 cm耕层，土壤基础养分为有机质24.04 g·kg-1、全氮1.56 g·kg-1、有效磷9.16 mg·kg-1、速效钾204 mg·kg-1。土壤物理机械组成为沙粒18.60 %、粉粒42.20 %、黏粒39.20 %。供试土壤自然风干后过2 mm筛，175 ℃高温灭菌2 h后备用。

供试玉米品种为郑单958，供试菌种分别为摩西斗管囊霉(Funneliformismosseae,FM)和地表球囊霉(Glomusversiforme,GV)，其中摩西斗管囊霉由北京市农林科学院植物营养与资源研究所“AMF种质资源库”(BGC)提供；地表球囊霉由浙江大学生命科学院程磊课题组提供。菌种以玉米为寄主植物进行扩繁，产生的菌剂包括相应的培养基质、孢子、根外菌丝及植物根段等，其中菌剂孢子密度为30个·g-1。

1.2 试验设计

盆栽试验为单因素试验设计，3个处理分别为：对照CK(灭菌土壤不接菌)；FM处理(土壤接种摩西斗管囊霉)；GV处理(土壤接种地表球囊霉)。试验盆上口径34 cm，下口径21 cm，高21 cm。每盆装灭菌风干土9 kg，根据前期研究结果[16]，接菌处理每盆添加100 g菌剂，菌剂与灭菌土壤充分混合后装盆；不接菌对照处理采用相同方法加入等量的灭菌土壤代替菌剂。所有处理均3次重复，随机排列。试验开始前每盆补充20 mL菌剂滤液以消除处理间细菌群落差异[16-17]。玉米播种前选择颗粒饱满的种子，每盆播种3粒，三叶期间苗，每盆保留1株长势相近的幼苗。试验期间采用土壤水分测定仪测定并定时补充水分，维持土壤含水量为田间最大持水量的60%。

1.3 取样与测定分析

玉米吐丝期采用日本产SPAD-502叶绿素仪测定穗位叶SPAD值，同时测量植株叶面积。并在玉米吐丝后10 d(10 days after silking，DAS 10),15 d(15 days after silking，DAS 15),20 d(20 days after silking，DAS 20)和成熟期分别进行取样。取样时玉米植株分为根、茎、叶、子粒等部分，经105 ℃杀青，75 ℃烘干至质量恒定后测定生物量。玉米植株各器官氮含量采用浓H2SO4-H2O2联合消煮，用AA3连续流动分析仪(SFACFAFIABRAN+LUEBBEⅢ)测定样品全氮含量。玉米子粒粗蛋白、粗脂肪采用近红外光谱仪(MATRIX-1)测定。

玉米子粒硝酸还原酶(nitrate reductase,NR)、亚硝酸还原酶(nitrite reductase,NiR)、谷氨酰胺合成酶(glutamate synthase,GS)、谷氨酸合成酶(glutamine synthetase,GOGAT)采用试剂盒法测定[18-20]。取样时，每个处理随机选取3株玉米植株，分别迅速采集5 g子粒，液氮冷冻，保存至冰箱(-80 ℃)后用于测定NR,NiR，GS和GOGAT酶活性。NR，NiR，GS和GOGAT酶活性的测定方法为：待测样本称取1 g，用液氮将标本研磨充分，加入9 g pH值7.2～7.4的1×PBS缓冲液充分冲洗研钵。采用Eppendorf Centrifuge 5810 R 高速冷冻离心机(Eppendorf,Germany)进行离心20 min(3 000 r·min-1)，仔细收集上清液。NR，NiR，GS和GOGAT试剂盒均采自上海酶联生物(货号分别为ml016956，ml076477，ml062646和ml076498)，以空白孔调零，在450 nm波长下用酶标仪(Rayto，RT-6100)依序测量各孔的吸光度(OD值)，所有测定在加终止液15 min以内进行。

玉米根系侵染率测定采取PHILLIPS等[21]的方法，即随机选取2 g玉米成熟期新鲜根段保存于50%乙醇中，后将根切成0.5～1 cm小段，酸性品红染色后，以侵染根段数在总根段数中百分比计算菌根侵染率。

玉米成熟期土壤孢子数采用湿筛倾注-蔗糖离心法筛选孢子[8]，即每个处理称取土样10 g，蒸馏水静置后过双层分样筛(上筛20目、下筛400目)，收集400目筛上的残留物，采用Eppendorf Centrifuge 5810 R 高速冷冻离心机进行3 000 r·min-1离心3 min后去掉上清液；加入质量体积分数45%～50%蔗糖溶液，搅匀，1 500 r·min-1离心2 min后取上清液，过400目筛，用质量分数为0.9% NaCl溶液收集残留物于培养皿中，备用。每个土样重复3次。将所分离的孢子材料置于Olympus显微镜下观察并记录孢子数量。

玉米成熟期根系形态指标采用EPSON EXPRESSION 11000XL根系扫描仪(Seiko Epson Corp,Japan)扫描后，利用WinRHIZO根系分析系统(Version Pro 2013,Regent Instruments Inc,Canada)分析扫描图片，获得根长度、根表面积、根体积和根直径等数据。

1.4 数据分析

采用one way ANOVA比较不同处理之间的差异性，并采用Duncan进行多重比较。所有数据均采用SPSS 25.0 软件进行统计分析，并采用Sigmaplot 14.0软件进行作图。

2 结果与分析

2.1 不同丛枝菌根真菌对玉米子粒产量、子粒氮素累积量及子粒品质的影响

从表1可以看出，与对照相比，AMF显著提高玉米子粒产量、子粒氮素积累量、子粒蛋白质含量和子粒脂肪含量，但对子粒淀粉和赖氨酸的影响不显著。与对照相比，FM和GV处理子粒产量分别增加18.29%和25.23%；子粒氮素累积量分别增加37.45%和42.96%；子粒粗蛋白分别增加12.64%和21.51%；子粒粗脂肪分别增加11.49%和12.79%。表明玉米接种不同AMF均可以显著提高其子粒产量、改善其子粒品质，但不同菌剂对产量提高和品质改善的作用存在差异，其中GV对玉米子粒产量、氮素积累量、粗蛋白和粗脂肪的作用相对较高。

表1 不同AMF对玉米子粒产量、子粒氮素累积量及子粒品质的影响Table 1 Effects of different AMF species on maize grain yield,grain nitrogen accumulation,grain quality

土壤孢子数和根系侵染率是评价AMF与植物亲和性的重要参数。由图1可以看出，2种AMF均能在玉米根系中形成侵染，并形成根内孢子和根内菌丝。由于本试验供试土壤是灭菌土，所以未接菌处理的土壤孢子数和玉米植株菌根侵染率视为0。与对照相比，接种AMF后土壤孢子数和根系侵染率均显著增加(表2)，表明2种AMF均与玉米根系有较高的亲和性，并能够有效地互相识别，其中侵染率相对较高的GV与玉米根系的亲和性更高，可以作为玉米的优势菌株。

图1 玉米吐丝期不同AMF(A:CK; B:FM; C:GV)处理之间根系侵染的光学显微镜 (OM) 显微照片Fig.1 Photomicrographs by optical microscope (OM) photomicrograph at 40×magnification of root infection in different AMF (A:CK; B:FM; C:GV) treatments at maize silking stage

玉米接种AMF显著改善根长、根表面积和根体积和根系直径(表2)。与对照相比，FM处理成熟期玉米根长、根表面积和根体积分别增加14.44%，9.88%和1.56%，GV处理分别增加64.54%，42.27%和19.92%；而FM和GV处理的玉米根直径分别降低5.65%和9.07%。这表明玉米接种AMF后，一方面，延长根系长度，扩大根系表面积和根体积，增加养分吸收面积；另一方面，降低玉米根系直径，深入到更微小的孔隙中，接触更多的养分，其中GV对玉米根系性状的改善作用高于FM。

表2 不同AMF对土壤孢子数、根系侵染率、根系性状、吐丝期穗位叶SPAD和叶面积的影响Table 2 Effects of different AMF species on soil spore numbers,root infection rate,root parameters,ear leaf SPAD and leaf area at silking stage

SPAD值是衡量植物叶绿素相对含量的一个重要参数，而叶面积指数是反映植物群体生长状况的一个重要指标，其大小与作物产量密切相关。方差分析结果表明(表2)，3种处理之间穗位叶SPAD均值和叶面积均差异显著，其中FM和GV处理的穗位叶SPAD和叶面积均显著高于对照。表明接种AMF后能显著提高玉米穗位叶叶绿素含量，增加光合吸收面积，改善玉米群体生长。

由表3可以看出，玉米灌浆前20 d，3个处理根、茎、叶生物量，根、茎、子粒氮含量和根、茎氮素累积量均呈下降趋势，而子粒生物量、叶氮含量、叶氮素累积量和子粒氮素累积量均呈上升趋势。与CK处理相比，FM和GV处理根、茎、叶、子粒生物量分别增加8.72%和17.44%，8.72%和7.24%，3.72%和4.64%，17.94%和15.68%；氮含量分别增加8.17%和12.87%，6.86%和8.54%，7.15%和11.53%，6.76%和7.72%；氮素累积量分别增加17.24%和33.04%，15.99%和16.28%，11.14%和16.54%，26.48%和24.66%，其中以GV处理的增加量相对较高。表明玉米接种AMF不仅能够显著提高植株生物量，而且能提高各器官，特别是子粒氮含量及其养分吸收能力，其中不同AMF在提高玉米子粒产量和氮吸收方面存在差异。

随灌浆进程推进，不同AMF处理玉米子粒NR，NiR，GS，GOGAT酶活性均呈上升趋势(表4)。3个处理之间NR，NiR，GS，GOGAT酶活性差异显著，其中FM处理的NR，NiR，GS，GOGAT酶活性平均值分别比对照增加10.67%，5.74%，2.23%和4.28%；而GV处理酶活性分别增加6.97%，7.25%，8.48%和12.17%。表明接种AMF后能显著增强灌浆前期玉米子粒氮代谢酶的活性，提高玉米子粒氮代谢能力，其中GV对玉米灌浆前期子粒氮代谢酶活性的改善作用高于FM。

3 结论与讨论

本研究发现，接种丛枝菌根真菌显著提高玉米子粒产量及其氮素积累量，同时改善玉米子粒部分品质性状。玉米子粒中40%～60%的氮素来自于根系的吸收，作物根系性状和根系营养吸收能力显著影响作物产量及其氮素积累量[20-21]。丛枝菌根真菌一方面通过侵染玉米根系形成根外菌丝，在土壤中形成庞大的菌丝网络，扩大根系养分吸收范围和吸收能力，获得植物根系无法直接获取的土壤养分和水分[22-23]。根外菌丝还能够进入直径较小根系不能进入的土壤孔隙内，吸收毛管水和矿质营养；并穿插进入土壤小孔隙中，增加土壤水稳性大团聚体数量，使土壤孔隙溶液中保存更多养分和水分，改良土壤结构，增加菌根植物从土壤中获取养分和水分的潜力[24]；菌丝还可以穿入有机物正在分解的微域或与其他微生物直接竞争分解产物，并将有机物分解释放的氮素转运给植物[25]。另一方面，丛枝菌根真菌通过改善根系结构增加寄主养分吸收能力[13,26]。在不同草本或木本植物上研究均发现，接种AMF后植物根长、根表面积、根投影面积等根系参数增加，水分和养分吸收能力增强，生物量增加；而降低根系直径使根系深入到较小的土壤孔隙内吸收养分[27]。这与本研究发现AMF显著改善玉米根系性状的结果基本一致。

玉米子粒中的氮素主要是输导系统运来的酰胺、脲和精氨酸等化合物，经过GS-GOGAT同化，转变成其他的合成贮藏蛋白所需的氨基酸[28]。较高的硝酸还原酶活性，有助于硝态氮的转化吸收和产量的增加；而且谷氨酰胺合成酶和谷氨酸合成酶是氨基酸合成和代谢的关键酶，是氮代谢过程中重要的调节酶和限速酶，对植物生长发育、产量形成有重要作用，其酶活性高低表明氮代谢及蛋白质合成能力的强弱[28]，较高的酶活性能够促进硝态氮转化吸收[5,7]。郑朝峰[29]发现，玉米子粒灌浆前期胚形成过程中GS，GOGAT活力大幅度提高，而且GOGAT活力高峰期与子粒氮素积累最活跃时期相一致。吕鹏等[30]也认为，施氮通过提高花后玉米NR，GS，GOGAT等酶活性，使玉米灌浆期氮代谢关键酶活性保持较高水平，保证玉米叶片中氮代谢系统的畅通和高效运转，提高植株和子粒的吸氮量。本研究发现，接种丛枝菌根真菌能显著提高玉米子粒氮含量，可能是AMF通过提高灌浆过程中玉米子粒氮代谢酶活性，促进了氨基酸合成和转化及蛋白质的形成所致。

姜德锋等[14]比较了Gigasporarosea，Glomusmosseae，Glomusversifome，Sclerocystissinousa4种丛枝菌根对玉米生理特性和子粒产量的影响后，发现GV在提高玉米根系活力和养分吸收能力、增加玉米叶片光合速率等方面作用显著。本研究也发现，不同AMF对玉米子粒产量的影响程度存在差异，其中GV的增产作用相对较大。不同丛枝菌根真菌在改善玉米产量和氮素吸收方面的差异，主要是因为不同丛枝菌根真菌对同一宿主作物的亲和性存在差异，相互之间的选择性对作物生长发育和产量形成的影响程度也不相同[31-32]。普遍研究认为，菌根侵染率越高，植物菌根化程度相应越高，菌根效应就越强[15,33]。菌根侵染后一方面促进营养物质活化运移，不断地为宿主提供磷素等营养物质；另一方面宿主为菌根真菌提供碳水化合物保证其生长发育的能量，提高菌丝生长量、根系侵染率和养分吸收量，促进植物生长发育[22-23]。