大熊猫犬瘟热抗体间接ELISA方法的初步建立及应用

潘广林，赵鹏鹏，高更更，雷颖虎，骆 琛，王兴龙

(1.秦岭大熊猫研究中心 珍稀野生动物救护基地，陕西 周至 710402;2.西北农林科技大学 动物医学院，陕西 杨凌 712100)

作为中国的标志性物种，大熊猫因其特殊的生态价值和科学价值而受到广泛的关注。通过建立自然保护区及人工繁殖等一系列措施，大熊猫数量有了较大的增长。但近年来，疾病给大熊猫保护造成严重威胁，其中犬瘟热最严重[1-2]。犬瘟热是由犬瘟热病毒(canine distemper virus，CDV)引起的一种急性、高致死性传染病，临床上以双相热、眼鼻黏膜分泌物增多等为主要特征。目前针对该病尚未开发出特异性的药物，疫苗免疫是预防犬瘟热的有效措施。由于缺乏大熊猫专用犬瘟热疫苗，因此多以犬用疫苗代替。但将该类疫苗用于大熊猫等野生动物存在一定的风险，犬用疫苗免疫后引起大熊猫和其他野生动物死亡或发生不良反应的案例在国内外均有报道[3-6]。雪貂源犬瘟热重组疫苗是一种新型犬瘟热疫苗，其安全性已经得到验证[7-9]，但由于缺少犬瘟热血清学检测方法，其免疫效果需要进一步研究确定。

对大熊猫全基因组及IgG重链的分析表明，大熊猫与犬的基因组最接近[10-11]，提示抗犬IgG二抗具有可替代抗大熊猫IgG二抗用于大熊猫疾病血清检测的可能。葡萄球菌A蛋白(Staphylococcal protein A，SPA)作为金黄色葡萄球菌细胞壁上的蛋白成分，能与大多数动物的IgG Fc片段非特异性结合，可替代传统酶标二抗用于传染病的诊断[12]，但SPA能否用于大熊猫疾病的血清学检测尚不明确。本研究以CDV H和F蛋白的短肽作为包被抗原，用实验室制备的抗大熊猫IgG Fc二抗、商品化的抗犬IgG二抗及SPA做二抗，探究3种二抗应用于大熊猫犬瘟热血清学检测的可行性，并以建立的方法评估大熊猫的免疫效果。

1 材料与方法

1.1 多肽和血清CDV H和F蛋白多肽由合肥国肽生物公司合成；大熊猫血清(免疫犬瘟热疫苗2周后采集，间隔9个月)由陕西省林业科学院珍稀野生动物救护基地提供。

1.2 主要试剂和材料HRP标记的鼠抗大熊猫IgG Fc二抗由实验室前期制备保存；HRP标记的兔抗犬IgG二抗购自北京博奥森生物技术有限公司；HRP标记的SPA购自博士德生物工程有限公司；TMB显色液购自北京索莱宝科技有限公司；CDV抗体ELISA 检测试剂盒购自上海加科生物科技有限公司。

1.3 最适包被质量浓度的确定利用方阵滴定法确定最适包被浓度。将CDV多肽以50 mg/L的起始质量浓度，2倍倍比稀释包被于酶标板，100 μL/孔，37℃孵育2 h。PBST洗涤3次，以10%的脱脂乳封闭2 h。PBST洗涤3次，获得包被好的反应板。

将大熊猫血清以1∶50的起始浓度包被于酶标板，37℃孵育1 h。PBST洗涤5次，加入HRP标记的鼠抗大熊猫IgG Fc二抗(100 μL，1∶1 000稀释)。PBST洗涤5次，加入50 μL TMB，37℃显色15 min，加入50 μL终止液，反应结束后测定阳性血清和阴性血清D450比值(P/N)，确定抗原和血清的最适包被浓度。

1.4 酶标二抗最佳稀释倍数的确定将大熊猫血清1∶100稀释后包被于酶标板，HRP标记的鼠抗大熊猫IgG Fc二抗和HRP标记的兔抗犬IgG二抗做1∶1 000～1∶4 000的2倍倍比稀释，HRP标记的SPA做1∶500～1∶2 000的2倍倍比稀释，反应结束后测定D450值，确定酶标二抗的最佳稀释倍数。

1.5 符合率试验确定抗原、血清最适包被浓度以及酶标二抗最佳稀释倍数后，利用建立的3种ELISA方法和商品化犬瘟热抗体试剂盒对12份大熊猫犬瘟热疫苗首免血清进行检测，比较3种方法和商品化犬瘟热抗体试剂盒检测结果的一致性。

1.6 敏感性试验在最佳反应条件下，对2倍倍比稀释的大熊猫阳性血清和阴性血清(1∶100～1∶12 800)进行检测，反应结束计算P/N，比较3种二抗用于大熊猫犬瘟热抗体检测的敏感性。

1.7 重复性试验利用建立的3种ELISA检测方法对12份血清进行批内和批间重复性试验，批内试验和批间试验均做3个重复，计算批内和批间差异的变异系数。

1.8 血清抗体检测根据上述试验确定的抗原、血清和酶标二抗的最适反应浓度，利用建立的3种ELISA方法对前后2次犬瘟热疫苗免疫的大熊猫血清进行检测，计算3种方法测得的二免与首免D450差值的平均值，得出免疫前后血清抗体水平的变化。

2 结果

2.1 最适包被质量浓度的确定根据反应结束D450和P/N值的最大值，确定最适抗原包被质量浓度为25 mg/L，血清最佳稀释倍数为1∶100(图1)。

图1 最适包被质量浓度的确定

2.2 酶标二抗最佳稀释倍数的确定将倍比稀释的3种酶标二抗与大熊猫血清反应，确定D450值最大时对应的稀释度为其最佳稀倍数，抗大熊猫二抗、抗犬二抗、SPA的最佳稀释倍数分别为1∶1 000，1∶1 000，1∶500(图2)。

2.3 符合率试验检测12份免疫犬瘟热疫苗的大熊猫血清，结果显示鼠抗大熊猫二抗、兔抗犬二抗、SPA和商品化犬瘟热抗体试剂盒(犬用)4种方法检测的阳性率分别为100%,92%,100%,50%。表明建立的3种ELISA检测方法符合率较高，一致性较好，阳性检出率远高于商品化试剂盒(图3,表1)。

2.4 敏感性试验将3种检测方法在P/N值≥2.1时对应的血清最大稀释度确定为该检测方法的敏感性，分别为1∶400，1∶100，1∶100(图4)。

图2 酶标二抗最佳稀释倍数的确定

图3 3种检测方法一致性比较

表1 3种检测方法和商品化试剂盒一致性比较

图4 3种检测方法的敏感性试验

2.5 重复性试验利用鼠抗大熊猫二抗、兔抗犬二抗和SPA建立的检测方法批内重复性试验的变异系数分别为0.06%～8.06%,0.16%～8.04%,2.27%～4.92%;批间重复性试验的变异系数分别为0.70%～9.26%,0.90%～8.52%,0.65%～8.87%，表明3种检测方法的重复性较好(表2)。

表2 3种检测方法的重复性试验 %

2.6 血清抗体检测结果前后2次免疫过犬瘟热疫苗的大熊猫血清抗体检测结果显示，二免过后， 50%(6/12)的个体抗体水平升高0.2以上，25%(3/12)的个体抗体水平升高0.1～0.2，25%(3/12)的个体抗体水平升高0.1以下(图5)。

图5 大熊猫2次免疫犬瘟热疫苗抗体水平变化

3 讨论

犬瘟热是由CDV引起的一种急性高致死性疾病，该病目前在全世界广泛流行，在中国主要流行的基因型是亚洲-1型[13-14]。自然条件下CDV主要感染包括犬科、鼬科、猫科在内的多种食肉目动物，但近年来CDV的宿主范围不断扩大，已经严重威胁到大熊猫的生存[1,2,15]。CDV是副黏病毒科、麻疹病毒属的一种有囊膜的单股负链RNA病毒[16]，基因组全长15 690 nt，分别编码核衣壳蛋白(nucleocapsid protein，N)、磷蛋白(phosphoprotein，P)、基质蛋白(matrix protein，M)、融合蛋白(fusion protein，F)、血凝素蛋白(hemagglutinin protein，H)、大聚合酶蛋白(large protein，L)6个蛋白[17]。H和F蛋白上存在许多抗原表位[18]，免疫原性较好，在抗感染免疫和诱导中和抗体的产生等方面发挥着重要作用[19-20]。梅里亚公司已研发出雪貂源的犬瘟热H和F蛋白金丝雀痘病毒重组活载体疫苗，该疫苗安全性已得到广泛验证。国外研究人员曾对来自中国的2只大熊猫免疫该重组疫苗并监测其抗体的动态变化，结果表明该疫苗可以诱导机体产生较高水平的中和抗体，能为大熊猫提供1年的免疫保护[9]。近期一项针对5只大熊猫免疫该疫苗后的血液转录组研究结果表明，该疫苗主要通过固有免疫应答和细胞免疫来发挥免疫保护作用，缺乏足够的记忆细胞维持长期免疫[21]。

通过将鼠抗大熊猫IgG Fc二抗、兔抗犬IgG二抗和SPA应用于大熊猫犬瘟热间接ELISA诊断，结果表明3种二抗均可用于大熊猫犬瘟热抗体的血清学检测，建立的3种检测方法对于样本的检测结果趋于一致，相比商品化试剂盒具有更高的准确性。利用大熊猫二抗建立的诊断方法敏感性更高，可作为首选二抗，但在缺乏大熊猫二抗时可选择另外2种二抗进行替代。通常认为，犬瘟热的抗体达到1∶100就具备对犬的完全免疫保护力，但对大熊猫是否具有免疫保护尚缺乏足够的试验论证。对大熊猫前后2次疫苗免疫的血清抗体监测结果表明，12只大熊猫在2次免疫后都产生了超过1∶100的中和抗体，但针对犬瘟热金丝雀痘病毒重组活载体疫苗的免疫应答，无论首免还是二免，都存在不同程度的个体差异，二免后仅有50%的个体产生了更强的再次免疫应答，提示在实际免疫过程中应根据不同个体制定免疫程序。由于间接ELISA的影响因素较多，无法对其试验条件逐一进行优化，本研究中建立的检测方法尚有一定的局限性，后续仍需做进一步的改进。

本研究对鼠抗大熊猫IgG Fc二抗、兔抗犬IgG二抗以及SPA用于大熊猫犬瘟热抗体血清学检测的可行性进行了试验论证，初步建立了针对大熊猫犬瘟热的血清学检测方法，完成了对大熊猫前后2次疫苗免疫血清抗体水平的评估，对大熊猫犬瘟热血清学检测试剂盒的开发、疫苗免疫效力的评估以及犬瘟热防控水平的提升具有重要意义。