高烧灵验方对酵母致热大鼠的解热机制研究

郭起岳，冯学轩，茹 丽，邝少松，严家荣，楼彩霞，黄 威，刘月姝，姚欣伶，张 洁

（1广东省医学实验动物中心 广东 佛山 528248）

（2广州中医药大学科技产业园 广东 广州 510445）

发热是临床疾病中最常见的症状表现，现代生理学和病理学认为，发热是在致热原的作用下，体温调节中枢的调定点上移而引起的调节性体温升高[1]。中医中药治疗发热性疾病有充分的临床基础和文献依据，退热效果显著，疗效稳定，不易反复，安全性高、不良反应少、适用范围广，具有广阔的市场前景。

高烧灵验方出自山西中医研究院内科主任医师胡兰贵编著的《临证效验秘方》，该方由胡兰贵医师集多年临床经验总结而来，其组成为柴胡20 g、黄芩10 g、瓜蒌60 g，主治邪入膜原、痰热阻滞证，症见高热不退、脉滑或沉滑弦。目前，该方已在临床应用多年，取得了良好的治疗效果，但有关该方的动物实验研究尚未见有相关的文献报道。笔者团队于2019年11月—2020年1月，采用现代药理实验方法，通过建立酵母致大鼠发热模型，验证高烧灵验方的解热作用，并探讨其机制，以期为其今后的深入研究和进一步的临床应用提供科学有效的实验依据。

1.材料

1.1 仪器HRQ-A3兽用电子体温计（郑州豪润奇电子科技有限公司）；Multiskan GO型全波长酶标仪（美国Thermo Fisher Scientific）。

1.2 药品与试剂

高烧灵验方（由柴胡20 g、黄芩10 g、瓜蒌60 g组成，共2剂，饮片均购自广东清源中药饮片有限公司）；阿司匹林肠溶片（拜耳医药保健有限公司中国北京，批号：190309208）；安琪高活性干酵母（安琪酵母股份有限公司，批号：CA10938）；白介素-6（IL-6）、白介素-1β（IL-1β）、前列腺素E2（PGE2）酶联免疫试剂盒（武汉华美Biotech,COLTD，批号：N15017103、N15017102、CO171030116）；环磷酸腺苷（cAMP）检测试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：20191113）。

1.3 动物SD大鼠，雄性，体质量180～220 g，由广东省医药动物实验中心提供（生产许可证号为SCXK（粤）2018-0002，动物合格证号44007200070622）。饲养于广东省医学实验动物中心SPF级动物房，使用许可证号：SYXK（粤）2018-0002，适应性饲养4 d后开始实验。

2.方法

2.1 高烧灵验方的煎制

按照处方取柴胡40 g、黄芩20 g、瓜蒌120 g（共2剂），10倍量纯净水浸泡30 min后，置煎药锅中，先武火煮20 min，然后转文火煎30 min，4层纱布过滤；药物残渣继续加8倍水量，同法煎煮并过滤，合并两次滤液并浓缩至180 mL，冷却至室温，即得浓度为1 g生药/mL的高烧灵验方水煎液，给药时用纯净水将水煎液稀释至所需浓度。

2.2 分组、造模及给药[2-4]80只雄性SD大鼠，适应条件后，连续2 d检测体温，选取基础肛温在36.5～38.0℃，波动在0.5℃以内的70只大鼠纳入实验。正式实验当天，连续测量体温2次，间隔30 min，以2次平均体温为致热前基础体温，按平均体温分层随机分为正常对照组（10只）和造模组（60只）。造模组大鼠皮下注射20%的酵母混悬液10 mL/kg体重，制备大鼠干酵母发热模型；正常对照组大鼠皮下注射等体积的氯化钠注射液。造模后，造模组大鼠每小时测体温1次，连续5次，5 h后体温升高不足0.8℃的大鼠淘汰，取体温升高合格的大鼠共50只，按体温分层随机分为模型对照组、阿司匹林组、高烧灵验方低、中、高剂量组。高烧灵验方低、中、高剂量组分别按2.5、5、10 g生药/kg灌胃给予高烧灵验方水煎液（浓度分别为0.25 g、0.5 g、1 g生药/mL的），阿司匹林组给药剂量为100 mg/kg，正常对照组和模型对照组灌胃给予等体积纯净水。

2.3 观察指标

2.3.1体温 给药后，每小时测量1次体温，连续4次。计算大鼠基础体温、造模后5 h、给药后1 h、2 h、3 h、4 h体温。

2.3.2血清及下丘脑各致热因子指标 给药后第4次测完体温后，按60 mg/kg腹腔注射3%戊巴比妥钠溶液麻醉后腹主动脉采血，分离血清；采血完毕，放血处死动物，取出下丘脑。运用ELISA法，按试剂盒说明书测定血清白介素-1（IL-1）、白介素-6（IL-6）含量，下丘脑环磷酸腺苷（cAMP）、前列腺素E2（PGE2）含量。

2.4 统计学方法

3.结果

3.1 高烧灵验方对发热大鼠体温的影响

与正常对照组比较，模型对照组大鼠基础体温无统计学差异（P＞0.05）；在造模后5 h、给药后1 h、2 h、3 h、4 h体温升高，具有统计学差异（P＜0.01）。与模型对照组比较，阿司匹林组、高烧灵验方低、中、高剂量组大鼠基础体温及造模后5 h体温无统计学差异（P＞0.05）；在给药后1 h、2 h、3 h、4 h，阿司匹林组、高烧灵验方中、高剂量组大鼠体温降低，具有统计学差异（P＜0.05），高烧灵验方低剂量组大鼠体温无统计学差异（P＞0.05）。

3.2 高烧灵验方对发热大鼠血清IL-1、IL-6含量及下丘脑cAMP、PGE2含量的影响（见表2）：与正常对照组比较，模型对照组大鼠血清IL-1、IL-6含量及下丘脑cAMP、PGE2含量升高，具有统计学差异（P＜0.01）。与模型对照组比较，阿司匹林组、高烧灵验方中、高剂量组大鼠血清IL-1、IL-6含量及下丘脑cAMP、PGE2含量降低，具有统计学差异（P＜0.05），高烧灵验方低剂量组大鼠无统计学差异（P＞0.05），见表1。

表1 高烧灵验方对发热大鼠体温的影响（±s, n=10）

表1 高烧灵验方对发热大鼠体温的影响（±s, n=10）

注：与正常对照组比较，**P＜0.01；与模型对照组比较，▲▲P＜0.01，▲P＜0.05。

组别 剂量 基础体温/℃ 体温/℃造模后5 h 给药后1 h正常对照组 - 37.87±0.13 37.81±0.20 37.86±0.14模型对照组 - 37.80±0.21 39.50±0.22** 39.47±0.24**阿司匹林组 100 mg/kg 37.85±0.10 39.48±0.25 38.32±0.24▲▲低剂量组2.5 g生药/kg 37.79±0.19 39.47±0.29 39.29±0.28中剂量组 5 g生药/kg 37.77±0.12 39.41±0.35 38.93±0.24▲▲高剂量组10 g生药/kg 37.87±0.13 39.47±0.26 38.61±0.21▲▲组别 剂量 体温/℃给药后2 h 给药后3 h 给药后4 h正常对照组 - 37.86±0.14 37.92±0.10 37.91±0.11模型对照组 - 39.62±0.33**39.71±0.21**39.54±0.16**阿司匹林组 100 mg/kg 38.26±0.34▲▲38.46±0.27▲▲38.48±0.32▲▲低剂量组2.5 g生药/kg 39.46±0.35 39.37±0.30 39.32±0.24中剂量组 5 g生药/kg 38.77±0.29▲▲38.72±0.35▲38.89±0.32▲▲高剂量组10 g生药/kg 38.39±0.26▲▲38.49±0.28▲▲38.51±0.31▲▲

表2 高烧灵验方对发热大鼠血清及下丘脑各致热因子的影响（±s, n=10）

表2 高烧灵验方对发热大鼠血清及下丘脑各致热因子的影响（±s, n=10）

注：与正常对照组比较，**P＜0.01；与模型对照组比较，▲▲P＜0.01，▲P＜0.05。

组别 剂量 血清IL-1β/（pg•mL-1） IL-6/（pg•mL-1）正常对照组 - 36.38±1.10 7.25±0.65模型对照组 - 42.88±3.77** 10.96±1.21**阿司匹林组 100 mg/kg 36.72±1.21▲▲ 7.29±0.68▲▲低剂量组2.5 g生药/kg 39.36±1.75 10.27±1.05中剂量组 5 g生药/kg 36.96±1.24▲▲ 8.28±0.94▲▲高剂量组10 g生药/kg 36.73±1.01▲▲ 7.53±0.77▲▲组别 剂量 下丘脑cAMP/（nmol•L-1） PGE2/（pg•mL-1）正常对照组 - 47.42±9.65 0.90±0.08模型对照组 - 67.77±6.80** 1.12±0.15**阿司匹林组 100 mg/kg 50.98±9.94▲▲ 0.91±0.08▲▲低剂量组2.5 g生药/kg 61.82±9.34 1.07±0.10中剂量组 5 g生药/kg 55.87±11.26▲ 1.00±0.11▲高剂量组10 g生药/kg 50.37±12.86▲▲ 0.92±0.11▲▲

4.讨论

发热是指机体在致热原作用下或各种原因引起体温调节中枢的功能障碍时，体温升高超出正常范围，而致热原包括外源性和内源性两大类。外源性致热源多为大分子物质，通过激活血液中的中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和单核巨噬细胞系统，使其产生并释放内源性致热原，即致热性细胞因子，内源性致热原直接或间接通过中枢介质作用于体温调节中枢，体温调定点上移，引起产热增加，散热减少，体温在一个新的调定点达到平衡时，从而导致体温升高[5-6]。

酵母所致发热是由于注射部位溃烂引起的剧烈炎症反应，能较好地模拟病理状态下的发热症状。该模型动物所表现出来的症状与临床近似，更适合用来考察清热药的解热作用[7]。目前研究表明[3,8-9]，酵母菌作为一种外源性致热原作用于机体，引发内生致热原细胞分泌内生致热原（IL-1，IL-6，TNF等），直接或通过中枢介质（PGE2，cAMP等）间接作用于下丘脑，使体温调定点上移，机体产热多或散热少，引起体温升高。本实验通过皮下注射20%酵母混悬液建立感染性发热大鼠模型，以观察高烧灵验方的解热作用及其机制。结果显示，造模后5 h，除正常组外，其余各组体温均明显升高，与正常组体温比较具有统计学差异，说明造模均成功，且模型组与各给药组间体温比较无统计学差异，故又保证了给药组与模型组的较好可比性。给药后1～4 h，模型组体温仍明显升高；高烧灵验方中、高剂量组体温明显降低，提示高烧灵验方有良好的解热作用。给药后4 h，模型组大鼠血清IL-1β、IL-6和下丘脑PGE2、cAMP含量均显著升高，与相关文献报道[3,6,9-10]一致；高烧灵验方中、高剂量组血清IL-1β、IL-6和下丘脑PGE2、cAMP含量与发热模型组比较均显著降低，提示高烧灵验方可降低血清IL-1β、IL-6的水平及下丘脑PGE2、cAMP的水平。

高烧灵验方组成简单，方中的柴胡、黄芩、瓜蒌均有良好的退热作用，为日常生活中的常见药，价廉易得，三药配伍较单味用药效果更好，这也体现了中医药“相须”配伍的科学性，具备中药配伍的基本特点。本文以柴胡、黄芩、瓜蒌配伍，充分运用现代药效学理论和实验方法，探讨柴胡、黄芩、瓜蒌配伍作为一个整体入药时表现出的解热作用及其机制，结果表明高烧灵验方可快速降温，效果确切，持续时间较长，其退热机制可能与抑制血清中IL-1β和IL-6的产生或释放，减少下丘脑PGE2和cAMP的合成，从而发挥解热作用有关。