生长激素在多柔比星诱导小鼠肝细胞损伤中的保护作用及相关机制研究

张 健，刘 维

（广东药科大学附属第一医院教学部 广东 广州 510080）

多柔比星，是临床常用的抗恶性肿瘤的药物，广泛用于多种实体瘤和血液系统肿瘤的治疗。该药物在发挥抗肿瘤作用的同时，普遍存在多种毒副作用，因此也限制了其在临床上的应用。肝脏作为人体全身最大的代谢器官，对于人体的稳态、新陈代谢等各个方面起着关键性的作用，对于药物引起的肝毒性可能与自由基的形成和活性氧（ROS）的产生有关。因此，抑制氧化应激可能是治疗Dox引起肝脏损伤的有效方法[1]。生长激素（GH）由生长激素细胞分泌，可促进细胞分裂和生长等。有报道表明，在病理情况下GH可以增加细胞的抗氧化能力，降低细胞中ROS的水平，增加细胞的抗氧化应激反应而发挥有效的保护作用[2]。线粒体是细胞内产生能量的场所。在维持细胞生长和新陈代谢起着十分重要的作用。而自噬是人体内重要的生理现象之一，可通过溶酶体降解和去除细胞内有害的蛋白质和受损的细胞器来提供营养，从而恢复代谢稳态。有研究表明，通过诱导增加线粒体自噬，能够对抗氧化应激并起到保护作用[3]。自噬的过程均由一种特殊的细胞器即自噬体所介导，其可分为非选择性和选择性，而自噬的选择性是由自噬受体所介导的[4]。p62是一种选择性自噬接头蛋白，将自噬和Keap1-Nrf2通路相关联，其中LC3相互作用结构域（LC3 interacting region, LIR）作为选择性自噬受体，穿梭于受损的蛋白质、线粒体和细胞器对其进行清除，在细胞选择性自噬过程中发挥重要的作用[5]；而KIR结构域（keap1 interacting region, KIR）参与氧化应激，与Keap1在胞质内形成复合体，将Keap1固定在细胞质中，增强细胞的抗氧化应激能力[6]。Keap1/Nrf2/NQO1信号通路是目前公认的机体抵抗内外环境氧化和有害刺激的重要防御性转导通路。Keap1是Nfr2的负性调节因子，Nrf2的激活可通过与Keap1解耦连或与p62形成复合体，进而启动下游保护性基因的表达，如醌氧化还原酶1（NQO1）等[7]。本文旨在探究GH对Dox诱导小鼠肝细胞损伤中发挥保护作用的相关作用机制。

1.资料与方法

1.1 实验动物

40只C57BL/6小鼠，SPF级，12周龄，购买于斯贝福（北京）生物技术有限公司，实验动物合格证号：SCXK（京）2019-0010，使用许可证编号：SYXK（粤）2017-0124。动物自由进食饮水，12 h明暗交替光照，环境温度22～25℃，相对湿度50%～55%。本实验所有操作均符合实验动物使用及保护条例，且通过本院伦理委员会审核通过。

1.2 药品和主要试剂

携带小鼠生长激素基因的重组腺相关病毒-8型（mGH-rAAV8）（广州派真生物技术有限公司）；BCA定量试剂盒、RT-PCR引物、Alexa Fluor 488和Alexa Fluor 594标记的山羊抗兔或抗大鼠IgG（Thermo Scientific公司）；动物RNA抽提试剂盒、DAPI染液（江苏碧云天生物技术公司）；逆转录、RT-PCR试剂盒（北京全式金生物公司）；兔抗小鼠Tom20、p62、GAPDH，大鼠抗小鼠Keap1、LC3抗体（Abcam公司）；HRP标记的山羊抗兔或抗大鼠IgG二抗、ECL发光液（Proteintech公司）。

1.3 免疫组织荧光法

将4%多聚甲醛固定的肝脏制成石蜡切片。随后进行抗原修复，用PBS漂洗后置于封闭液中，于室温下孵育40 min，加入p62、Keap1、Tom20、LC3（1:500）一抗于4℃孵育过夜，次日PBST漂洗3次，在暗室分别加入Alexa Fluor 488和Alexa Fluor 594标记的二抗于室温下孵育1 h, PBST漂洗3次，最后用DAPI染液进行复染10 min, PBS漂洗后于荧光显微镜下进行观察并拍照。

1.4 实时荧光定量PCR（real time-PCR）

取上述1.3等量的肝脏，利用动物RNA抽提试剂盒，提取肝组织中的总RNA。利用逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA。根据试剂说明书进行实时荧光定量PCR。RTPCR引物序列见表1。以GADPH作为待测GH的内参进行分析。所有实验单独重复3次。

1.5 Western blot实验

随机选取各组小鼠的肝脏，提取组织中的总蛋白。BCA法进行蛋白定量。取50 μg的蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳进行蛋白分离，采用湿转法将分离的蛋白转至PDVF膜上，5%的脱脂奶粉于室温下孵育1 h后，分别加入p62、Keap1、Nrf2、NQO1（1:1000）的一抗，4℃摇床孵育过夜。用TBST溶液清洗，以HRP标记的二抗（1:1000）室温孵育1 h，以TBST溶液清洗。最后均匀滴加ECL发光液后于凝胶成像仪进行曝光拍照[7]。以上实验单独重复3次。

1.6 统计学方法

采用SPSS 19.0和GraphPad Prism 5.0进行统计分析，计量资料用均数±标准差表示。两组间比较用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）的Dunnett’s或Bonferroni’s多重比较进行分析；P＜0.05认为差异具有统计学意义。

2.结果

2.1 GH能增加肝细胞线粒体的自噬对Dox诱导的肝脏损伤发挥保护作用

如上所述，通过增加线粒体的自噬，能够对抗氧化应激并起到保护作用[3]。我们运用免疫组织荧光技术对各组中肝细胞中的线粒体自噬情况进行检测。结果显示，与正常对照组和模型对照组相比，mGH-rAAV8低、高剂量组能够增加肝细胞的线粒体自噬，且高剂量组的效果更为明显，见图1。

图1 肝细胞线粒体自噬荧光图

2.2 GH对Dox诱导的肝脏损伤中Keap1/Nrf2/NQO1信号通路的影响

Keap1/Nrf2/NQO1信号通路是机体抵抗内外环境氧化等的重要防御性转导通路[7]。我们随机选取各组的肝脏组织，对p62、Keap1、Nrf2和NQO1表达水平进行检测。Real time-PCR和Western blot实验结果显示，与非药物治疗组相比，药物治疗组中的GH表达水平显著增高；与空白对照组和模型对照组相比，药物治疗组中p62、Keap1、Nrf2和NQO1表达显著增高，见图2。

图2 （A）各组Nrf2、Keap1、p62、NQO-1表达结果，（B）各组GH mRNA表达情况，（C）各组荧光图

从以上结果可以得出，生长激素能够通过上调p62的表达从而增加线粒体的自噬，同时可以上调Keap1、Nrf2和NQO1表达，进而发挥对肝脏的保护作用。

3.讨论

Dox是常用的抗肿瘤药物，因其具有较多的毒副作用，故临床使用经常受到限制[1]。在该实验中，从模型对照组可见，Dox能引起较为严重的肝脏损伤。我们通过尾静脉注射包含GH序列的rAAV8，结果显示，注射该药物后能有效改善Dox诱导的肝脏损伤。

线粒体的自噬是生物体维持内环境稳态重要的生理现象[8]。p62能将自噬和Keap1-Nrf2通路相关联[7]。如上所述，Nrf2是体内抗氧化调节的重要蛋白。鉴于此，我们猜测GH可能是通过增加细胞p62的表达进而增强线粒体的自噬，并进而调控Keap1/Nrf2/NQO1信号通路，对Dox诱导的肝脏损伤发挥保护作用。该研究的免疫组织荧光实验结果表明，与正常对照组和模型对照组相比，mGH-rAAV8低、高剂量组能够增加肝细胞的线粒体自噬，且高剂量组的效果更为明显。同时Real time-PCR和Western blot实验结果显示，mGH-rAAV8低、高剂量组p62、Keap1、Nrf2和NQO1表达显著增高，且高剂量组的增高更为显著。

综上所述，GH保护Dox诱导的肝脏损伤可能是通过增强细胞的线粒体自噬并参与调控Keap1/Nrf2/NQO1信号通路，从而增强细胞的抗氧化应激能力来实现的。其具体的机制仍需进一步阐明。