β-环糊精包合羚珠散的制备工艺及其抗惊厥活性分析

薛 铮，杜丹阳，刘嫣蓉，杨 琰，刘 莹，刘 康，石心红（通讯作者）

（中国药科大学 江苏 南京 211198）

羚珠散作为一种儿科散剂，常用于治疗小儿发热惊厥。在2015版药典之前，散剂不允许添加辅料。石菖蒲油和冰片是羚珠散中挥发性成分，不稳定[1]，致使其在制剂生产和贮存过程中损失较大[2]。中医治疗痫症有长久的历史。羚珠散在治疗癫痫时起效缓慢，但作用时间持久，可以有效遏制脑细胞异常放电而引起的热性惊厥[3]。因此，本研究采用环糊精包合的技术，有效提高其稳定性的同时，保证该方的药效。本实验采用研磨法制备β-环糊精（β-CD）包合物，通过正交设计法研究冰片和石菖蒲油的包合最佳工艺条件。此外，通过戊四氮（PTZ）致痫小鼠模型[4]，考察羚珠散原方及优化方对小鼠癫痫样行为的影响，探究其抗痫的生理机制。

1.实验材料

1.1 仪器与设备

MT5超微量级天平（METTLER TOLEDO公司），BT 125D电子天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]，LQ-C50001电子天平（深圳市飞亚衡器有限公司），KH-500DB型数控超声波清洗器（昆山市禾创超声波仪器有限公司），YL-100B实验室超纯水机（深圳市亿利源水处理设备有限公司），DZF-6090真空干燥箱（上海精宏实验设备有限公司），DHG-9023A电热恒温鼓风干燥箱（上海申贤恒温设备厂），DIONEX UltiMate 3000 Autosampler UHPLC液相色谱仪（赛默飞世尔科技公司），GC-2010气相色谱仪（日本岛津公司）。

1.2 药品与试剂

石菖蒲油、冰片、朱砂和羚珠散（由雷允上药业集团有限公司提供，批号：8-030725、BP1807003-180821、20181202-181224和SAob003），环糊精（国药集团化学试剂有限公司，批号：20161215），β-细辛醚（中国食品药品检定研究院，批号：112018-201601），龙脑（中国食品药品检定研究院，批号：110881-201709），戊四氮（上海源叶生物科技有限公司，批号：A20J10 L91178），苯妥英钠（安徽双鹤药业有限责任公司生产，批号：180419 6B），甲醇（色谱纯，美国天地有限公司）。其他试剂均为分析纯。

1.3 动物

SPF级 雄 性ICR小 鼠（3～4周），体 重14～18 g，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司，实验动物许可证号码SCXK（沪）2018-0006。所有实验操作均符合动物伦理学要求（伦理审批号：CPU2019021）。

2.混合挥发性成分β-CD包合物的制备及药效学评价

2.1 HPLC法测定包合物中β-细辛醚的含量

PRAZIS Absolute® C18色谱柱（250 mm×4.6 mm,5 μm）；流动相：甲醇-水（60:40）；检测波长：253 nm；流速：1 mL/min；柱温：30℃；进样体积：10 μL。理论塔板数以β-细辛醚计算应不低于6 000。

2.2 GC法测定包合物中龙脑的含量

以WONDACAP 1为固定相的毛细管色谱柱（30 m×0.53 mm，1.50 μm）；氢火焰离子化检测器（FID）；柱温：100℃保持1 min，10℃/min程序升温至250℃；气化室温度：270℃；检测器温度：270℃；载气：He；色谱柱流量：6.89 mL/min；尾吹气：N2，30.0 mL/min；氢气流量：40.0 mL/min；空气流量：400 mL/min；分流比：10:1；进样量：1 μL。理论塔板数以龙脑计算应不低于6 000。

2.3 包合工艺的优化

精密称取适量β-CD置于研钵中，加入适量纯水研磨均匀。精密称取冰片和石菖蒲油，加入无水乙醇溶液混匀。将上述溶液滴入研钵中，在规定时间内连续研磨至糊状。先用少量水洗，再用少量乙酸乙酯洗，于45℃真空干燥5 h，精密称定包合物质量，通过下列计算包合物得率。采用正交试验优化混合β-CD包合物的包合工艺，选取影响因素较大的研磨时间（A）、挥发油与β-CD的比例（B）及挥发油与水的比例（C）。

包合物得率=包合物质量/（挥发性成分投入量+环糊精投入量）×100%

2.4 包合物的包合率和含油率测定

精密称定包合物粉末100 mg，置50 mL容量瓶中，加入甲醇，充分振摇，超声处理1.5 h，放冷，定容至刻度线，0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液1。取包合物粉末约100 mg，精密称定，置50 mL容量瓶中，加入无水乙醇，充分振摇，超声处理60 min，放冷，定容至刻度线，0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液2。精密吸取供试品溶液1按照“2.1”，供试品溶液2按照“2.2”项下条件进行测定，测定β-细辛醚和龙脑的峰面积。通过下列公式计算包合物中包合率和含油率。正交实验结果见表1，方差分析见表2。

表1 正交试验表

表2 方差分析表

包合率=称取样品中挥发性成分的重量/[挥发性成分投入量×（称取样品的重量/包合物总重量）×空白回收率]×100%

含油率=称取样品中挥发性成分的重量/[（挥发性成分投入量+环糊精投入量）×空白回收率]×100%

方差分析结果显示，影响包合物包合效果的主次关系为环糊精与水比例>研磨时间>挥发油与环糊精的比例。最优参数为：研磨时间35 min，投料比1:8，溶剂比1:1。其中投料比和溶剂比对工艺都有显著影响。

2.5 验证试验

按筛选出的最佳包合工艺进行验证。分别制备3批包合物，包合物得率、包合率和含油率平均值分别为97.78%、98.23%、4.50%，表明该工艺稳定可行。

2.6 戊四氮诱导小鼠惊厥

取ICR小鼠按体重随机分组，每组10只，共6组：模型组，阳性药组（苯妥英钠50 mg/kg），羚珠散原方高低剂量组（1.0、0.5 g/kg），羚珠散优化方高低剂量组（1.0、0.5 g/kg）。每天给药组灌胃给予不同剂量药液（0.1 mL/kg），模型组给予0.9%氯化钠溶液，连续3 d，末次给药前禁食不禁水12 h。末次给药后1 h，腹腔注射PTZ（110 mg/kg）。观察小鼠发作时的行为变化，按Racine分级[5]，记录其从注射PTZ到发生惊厥的阵挛潜伏期、强直潜伏期、死亡时间。相比于模型组，各组强直潜伏期和死亡时间都有明显延长，且呈剂量依赖性。阳性药组和优化方高低剂量组的强直潜伏期和死亡时间，与模型组相比差异有统计学意义（P＜0.01）。经Fisher确切概率法检验，提示死亡率差异有统计学意义。通过组间的两两比较，阳性组、优化方高低剂量组与模型组差异有统计学意义（P＜0.05），说明这三组能显著抑制戊四氮导致的小鼠死亡。提示羚珠散中挥发性成分的包合是有意义的，见表3。

表3 羚珠散原方及优化方对戊四氮致痫小鼠的影响（±s, n=10）

表3 羚珠散原方及优化方对戊四氮致痫小鼠的影响（±s, n=10）

注：与空白组比较，*P＜0.05；**P＜0.01。

组别 阵挛潜伏期/s 强直潜伏期/s 死亡时间/s 死亡率/%模型组 41.80±7.35 281.30±147.62 314.60±149.57 100.00阳性药组 52.20±5.81 1 800.00±0.00* 1 800.00±0.00* 0.00*原方低剂量组45.90±5.45 510.60±453.88 603.60±442.99 90.00原方高剂量组47.60±7.39 614.40±432.44 646.60±418.92 90.00优化方低剂量组 48.10±11.13 1 051.90±536.81*1 338.40±496.86*50.00*优化方高剂量组 57.20±15.25 1 212.60±521.90*1 445.00±475.13*40.00*

3.讨论

本实验基于羚珠散中挥发性成分不稳定而展开，从企业的生产条件和工艺技术的成熟程度考虑，本研究选择将石菖蒲油和冰片制备成β-CD包合物。β-CD的空腔大小适合包合挥发油这类相对分子质量较小的成分，且成本较低。研磨法因为操作简单，且包合率较高，在生产上被广泛使用。正交试验结果说明优化后的包合物制备方法简单可行、重复性好。

惊厥实验结果表明，羚珠散在包合后能显著延长惊厥小鼠的存活时间，降低死亡率，且比未包合的组方抗惊厥效果更优，为羚珠散包合工艺研究提供了理论基础。石菖蒲油的抗癫痫作用在临床上已有较多文献报道。而石菖蒲油和冰片的“引药上行”作用，也使得这两味药作为佐使药，在治疗癫痫时被广泛配伍使用[6]。因此，这两味药在羚珠散的抗癫痫活性中起到重要作用。本研究初步验证了包合物的体内抗惊厥活性，但关于其抗惊厥作用的分子机制及其在体外是否也有较好的抗惊厥作用等尚不清楚，需要更深入的研究。