泽泻汤标准颗粒中白术内酯Ⅲ和23-乙酰泽泻醇B含量的检测方法探讨

吴 俊，林徐剑，施晓萍

（正大青春宝药业有限公司 浙江 杭州 310023）

泽泻汤标准颗粒处方来源于《金匮要略》（东汉张仲景）。主治水停心下，清阳不升，浊阴上犯，头目昏眩，现用于耳源性眩晕[1-3]。泽泻汤标准颗粒由泽泻和白术2味药物组成，泽泻中主要有三萜类、倍半萜类、二萜类化合物和其他成分，其中23-乙酰泽泻醇B具有降脂、利尿的活性[4-5]。白术主要有苷类、多糖类、挥发性成分和氨基酸类等，其中白术内酯类成分是白术的药效成分，具有较好的降脂、抗炎活性。白术内酯Ⅲ是内酯类成分的主要物质之一，含量较高，性质稳定[6-7]。所以含量测定指标为白术内酯Ⅲ和23-乙酰泽泻醇B。通过含量测定，为泽泻汤标准颗粒质量评价提供依据。

1.仪器与材料

高效液相色谱仪（Agilent1260系列，DAD检测器），色谱柱为Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18（250 mm×4.6 mm，5 µm）；KQ-100DE超声波清洗器（昆山超声）；BS-224 S型电子分析天平（赛多利斯）。乙腈（色谱纯，美国天地），其他为分析纯，水为超纯水，23-乙酰泽泻醇B对照品（购于中国食品药品检定研究院，批号：111846-201504，含量以99%计算），白术内酯Ⅲ对照品（购于中国食品药品检定研究院，批号：111978-201501，含量以99.9%计算）。

2.方法

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18（4.6 mm×150 mm, 5 μm）；流动相：乙腈-水，梯度洗脱，梯度洗脱程序见表1；流速：1.0 mL/min；柱温：30℃；波长：208 nm（检测23-乙酰泽泻醇B）、222 nm（检测白术内酯Ⅲ），见表1。

表1 流动相梯度表

2.2 样品溶液制备方法

2.2.1对照品溶液的制备 分别取适量的白术内酯Ⅲ对照品、23-乙酰泽泻醇B对照品，精密称定，加入60%甲醇制备，即得。

2.2.2供试品溶液的制备 取泽泻汤颗粒（规格：4 g/袋）适量，研细，混合均匀，精密称取2 g，置具塞锥形瓶中，加入60%甲醇25 mL，密塞，称定重量，超声处理（功率300 W，频率45 KHz）30 min，放至室温，再称定重量，用60%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3 方法学考察[3,8]

2.3.1线性 取配置好的对照品溶液，进样不同体积的量，进样检测，以对照品峰面积（X）为横坐标，对照品进样量（Y）为纵坐标作图，绘制标准曲线，计算回归方程，见表2。

表2 线性关系考察结果

2.3.2专属性 将泽泻汤标准颗粒处方中泽泻去除，即只有白术，按泽泻汤的制备方法制备成颗粒，配制成缺泽泻的空白阴性对照溶液。相同方法制备成缺白术的空白阴性对照溶液。将上述空白阴性对照溶液进样检测。结果：各空白阴性对照溶液色谱图中，在含量测定成分的色谱峰保留时间处无其他色谱峰出现，专属性良好。见图1～2。

图1 23-乙酰泽泻醇B阴性对照色谱图

图2 白术内酯Ⅲ阴性对照色谱图

2.3.3精密度（包括重复性和中间精密度）

2.3.3.1重复性 按供试品处理方法平行处理6份，进样10 μL测定，根据白术内酯Ⅲ、23-乙酰泽泻醇B峰面积和对照品线性方程，计算白术内酯Ⅲ、23-乙酰泽泻醇B含量和RSD。白术内酯Ⅲ含量平均值为0.597 mg/袋，RSD为1.23%；23-乙酰泽泻醇B含量平均值为1.671 mg/袋，RSD为1.54%。

2.3.3.2中间精密度 3人处理样品，使用同一设备测定含量，操作方法同重复性试验，考察不同人员所测得各成分含量和RSD。白术内酯Ⅲ含量平均值分别为0.597 mg/袋、0.593 mg/袋、0.593 mg/袋，RSD为0.39%；23-乙酰泽泻醇B含量平均值分别为1.671 mg/袋、1.651 mg/袋、1.613 mg/袋，RSD为1.79%。

2.3.4准确度（回收率实验）

取已知含量的泽泻汤标准颗粒样品6份，取样量为1 g，加入定量的对照品溶液，按供试品处理方法制备，测定含量，计算回收率。白术内酯Ⅲ回收率试验平均回收率结果为102.18%，RSD为0.67%；23-乙酰泽泻醇B回收率试验平均回收率结果为100.35%，RSD为1.73%。数据列于表3～表4。

表3 白术内酯Ⅲ回收率试验测定结果

表4 23-乙酰泽泻醇B回收率试验测定结果

2.3.5耐用性

2.3.5.1溶液稳定性。取同一供试品溶液分别于0～24 h进样，测定白术内酯Ⅲ和23-乙酰泽泻醇B的峰面积并计算RSD。结果：白术内酯Ⅲ的RSD为0.43%，23-乙酰泽泻醇B为0.77%。说明24 h内溶液稳定性良好。

2.3.5.2色谱柱柱温的变化。实验方法按照含量测定的供试品溶液配置方法，保持其他色谱条件不变，改变柱温±5℃（30±5℃），测定样品含量，考察RSD。结果：柱温25℃白术内酯Ⅲ含量平均值0.587 mg/袋，RSD为1.58%，23-乙酰泽泻醇B含量平均值为1.849 mg/袋，RSD为1.01%；柱温35℃白术内酯Ⅲ含量平均值0.597 mg/袋，RSD为1.46%，23-乙酰泽泻醇B含量平均值为1.791 mg/袋，RSD为0.83%。说明在柱温±5℃（30±5℃）的情况下，含量检测结果不受影响。

2.3.5.3检测波长的变化。实验方法按照含量测定的供试品溶液配置方法，保持其他色谱条件不变，改变检测波长±5 nm[白术内酯Ⅲ为（222±5）nm，23-乙酰泽泻醇B为（208±5）nm]，测定样品含量，考察RSD。结果：白术内酯Ⅲ在波长217 nm下含量平均值为0.593 mg/袋，RSD为1.43%，在波长227 nm下含量平均值为0.596 mg/袋，RSD为1.44%；23-乙酰泽泻醇B在波长207 nm下含量平均值为2.003 mg/袋，RSD为0.52%，在波长213 nm下含量平均值为1.935 mg/袋，RSD为0.45%。说明在检测波长±5 nm的情况下，含量检测结果不受影响。

2.3.5.4流速的变化。实验方法 按照含量测定的供试品溶液配置方法，保持其他色谱条件不变，改变流速为（1.0±0.1）mL/min，测定样品含量，考察RSD。结果：流速0.9 mL/min时，内酯Ⅲ含量平均值0.589 mg/袋，RSD为1.30%，23-乙酰泽泻醇B含量平均值为1.975 mg/袋，RSD为0.65%；流速1.1 mL/min时，内酯Ⅲ含量平均值0.588 mg/袋，RSD为1.28%，23-乙酰泽泻醇B含量平均值为1.972 mg/袋，RSD为0.70%。说明在流速为（1.0±0.1）mL/min的情况下，含量检测结果不受影响。

2.4 样品的含量测定

取4批样品按正文中含量测定项下供试品溶液的制备与测定方法进行制备与测定，测定结果，见表5。

表5 样品的含量测定结果

3.讨论

该含量测定方法在同一色谱条件下，利用流动相梯度洗脱的方式和DAD检测器同时开启2个被测成分的检测波长，同时测定白术内酯Ⅲ和23-乙酰泽泻醇B的含量。该方法进行了多种流动相梯度洗脱条件的摸索。最终选择乙腈-水为流动相，以及最佳的梯度洗脱条件，并且研究了不同提取溶剂（20%甲醇、40%甲醇、60%甲醇、80%甲醇、甲醇）对供试品的超声提取研究，从含测成分的色谱峰峰面积以及分离度等方面考虑，优选60%甲醇。并且明确了色谱柱类型、流速、波长、柱温等参数。经过方法学验证，此含量测定方法有良好的精密度、准确度、线性、范围、耐用性，且专属性无干扰完全符合要求。

综上所述，一般中药复方制剂对于检测不同药味中的不同成分，采用不同的色谱条件进行检测。本方法采用同一色谱条件同时测定泽泻汤标准颗粒中白术内酯Ⅲ和23-乙酰泽泻醇B含量，能够简化供试品制备步骤、提高检测效率、降低检测成本。