RAG1基因新发突变1例分析及文献复习

刘婉文，杨在东，叶文华

(佛山市妇幼保健院重症监护科，广东 佛山 528000)

联合免疫缺陷病(combined immunodeficiency，CID)是指T淋巴细胞和B淋巴细胞功能联合缺陷引起的原发性免疫缺陷病，以T淋巴细胞缺如尤为严重和突出。患儿早期可出现致死性严重感染、生长发育障碍及机会性感染。机会性感染最常见的部位是呼吸道，尤其是肺脏[1]，如卡氏肺孢子菌(Pneumocystis carinii，PC)、巨细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)感染。CID最危重的类型是重症联合免疫缺陷病(severe combined immunodeficiency disease，SCID)，不经造血干细胞移植治疗，患儿通常于1岁内夭折，很少能活过2岁[2]。CID的发病机制涉及多个基因，包括重组激活基因(recombination activating gene，RAG)1或RAG2、CD3g、链相关蛋白-70(Zeta-associatedprotein-70，ZAP-70)、潜伏相关转录子(latency associated transcript，LAT)、淋巴细胞酪氨酸激酶(lymphocyte tyrosine kinase，LCK)、杂合CARD11变异(heterozygous dominant negative CARD11 variants)、黏膜相关淋巴瘤易位基因1(mucosa associated lymphoma translocation genes，MALT1)、白细胞介素(interleukin，IL)-21、磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶催化亚基δ(phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit delta，PIK3CD)等[3]。

本文通过回顾分析我院于2020年3月收治的1例CID患儿的临床资料，探讨该患儿的临床表现及基因变异特点。

1 临床资料

本研究已通过我院医学伦理委员会批准(批准文号：FSFY-MEC-2020-065)。患儿，女，2个月，体质量5kg。因“发热、咳嗽2天”入院，入院后病情加重，进展为重症肺炎、急性呼吸窘迫综合征。

1.1 实验室检查

血常规多次提示淋巴细胞绝对值偏低，最低0.95×109/L，外周血CD3+T淋巴细胞绝对数1.05×109/L，CD3+CD4+T淋巴细胞绝对数为0.26×109/L，CD3+CD8+T淋巴细胞绝对数0.44×109/L，CD4+/CD8+T淋巴细胞绝对数0.59×109/L，自然杀伤(natural killer，NK)细胞绝对数2.53×109/L，B淋巴细胞绝对数0.03×109/L；免疫三项：IgG 481.40mg/L，IgA 3.00mg/L，IgM 122.20mg/L。结合上述临床资料，支持CID诊断。气管插管吸取深部痰液行高通量基因测序检查，提示PC 949个序列数，CMV 61 093个序列数，支持CMV、PC肺炎。

1.2 影像学检查

胸片及胸部CT均见双肺弥散分布磨玻璃密度灶，未见胸腺影，提示胸腺发育不良，见图1。

注：患儿胸部正位片(左图)及胸部CT平扫(右图)可见双肺弥散分布磨玻璃密度灶，未见胸腺影，提示胸腺发育不良。图1 患儿胸片及胸部CT图Fig.1 Chest radiographs and chest CT images of the child

1.3 治疗结果

给予更昔洛韦、复方新诺明联合亚胺培南西司他丁、利奈唑胺抗感染，患儿体温逐渐稳定，有创通气13天后顺利撤机，最后病情治愈出院。

为了进一步明确诊断，经家长知情同意后，分别抽取患儿及父母外周血2mL，外送基因检测。提取患儿DNA，并扩增建立含目标基因的全外显子文库，利用液相捕获试剂盒捕获目标基因，然后进行高通量测序。这个基因包检测区间包括5 177个相关基因，74 566个编码区总共含有12 424 088个碱基。平均覆盖深度202+/-60X，大于10X覆盖区间占99.4%，大于20X覆盖区间占99.2%)，找出相关可能致病基因，用Sanger测序验证患儿父母相应的突变。结果显示，患儿RAG1基因存在一处纯合子突变c.3074dupT(重复突变)，导致氨基酸改变p.L1025Ffs*40(移码突变40位后蛋白翻译提前终止)，对蛋白功能的影响可能较大。家系验证父母均为杂合状态，患儿为纯合状态，该突变的遗传方式为常染色体隐性遗传(autosomal recessive inheritance，AR)。

根据美国医学遗传学与基因组学会联合美国分子病理学会制订的基因序列变异解释标准和指南[4]进行致病性分析：c.3074dupT突变为移码突变，预测可能会导致蛋白质合成延迟，出现氨基酸的终止密码；家系验证父母均为杂合状态，患儿为纯合状态，该突变的遗传方式为AR；患儿临床表现与RAG1基因突变导致的相关基因疾病(细胞体液联合免疫缺陷伴肉芽肿、Omenn综合征和B-型重症联合免疫缺陷)符合。综上所述，结合患儿的临床表现和家系分析，依据美国医学遗传学与基因组学会变异分类指南(PMID:25741868)，这个变异为“2类-可能致病”。目前为止，c.3074dupT(p.L1025Ffs*40)这个新型变异没有在相关临床病例中被报道过。患儿及其父母的一代测序图见图2、图3、图4。

图2 患儿Sanger测序验证Fig.2 Sanger sequencing verification of the child

图3 患儿父亲Sanger测序验证Fig.3 Sanger sequencing verification of the father of the child

图4 患儿母亲Sanger测序验证Fig.4 Sanger sequencing verification of the mother of the child

患儿肺炎治愈出院后到复旦大学附属儿科医院治疗。患儿5个月大时，脐带血干细胞移植(umbilical cord blood stem cell transplantation，UCBT)成功。移植后最近一次随访时间为患儿11个月，正在进行抗排斥和抗感染治疗。

2 讨论

2.1 RAG1和RAG2是与CID相关的常见基因，可引起广泛的临床和免疫表型

SCID是免疫缺陷最严重的类型，功能性T淋巴细胞和B淋巴细胞发育受干扰，患儿极易遭受致命性感染。一些患者表现较弱的临床表型称为CID[5]。CID发病涉及多个基因，其中RAG1和RAG2中的亚型突变代表了与CID相关广泛的临床和免疫表型谱的原型[3]，也是与SCID相关的第二大流行基因[6]。RAG变异发生率各国报道不一样，有报道显示英国的原发性免疫缺陷(primary immunodeficiency，PID)患者RAG1基因变异占10.56%[7]，在科威特由RAG1/2或DCLRE1C突变引起的可变(variable，V)、多样性(diversity，D)和连接(joining，J)基因重组缺陷占常染色体隐性遗传CID的24%[8]。

目前鉴定出RAG1和RAG2致病突变200多种，可引起广泛的临床和免疫表型[9]。RAG突变体保留的重组活性与临床表现的严重程度相关[10]。根据基因异常对RAG分子活性影响程度的不同，可将RAG缺陷病分为无VDJ重排功能的RAG完全缺陷(重排活性<1%野生型)和低活性VDJ重排功能的RAG残留缺陷(重排活性>1%野生型)两大类[11]。双等位基因RAG1和RAG2突变导致的临床和免疫表型，包括典型的SCID和Omenn综合征、泄漏型SCID、迟发性联合免疫缺陷伴肉芽肿和/或自身免疫(CID-G/A)和常见可变免疫缺陷(common variable immunodeficiency，CVID)等[12-13]。然而，RAG缺乏症患者的基因型与表型相关性不是绝对的[14]。Al-Herz等人[8]报道的6例具有相同的纯合错义突变RAG1中，5例临床表型为Omenn综合征，1例表现为SCID，这可能是由于VDJ重组过程的随机性加上与环境因素协同所致。

2.2 RAG1突变部位与免疫缺陷表型的相关性

RAG定位于人类染色体11p13,由2个相邻的基因RAG1和RAG2组成[11]。RAG1和RAG2各由2个外显子组成，其编码区位于第2外显子中，分别编码1 043和527氨基酸。RAG1编码产物Rag1蛋白形成的复合物是最重要的重组酶之一，Rag1蛋白的核心氨基酸区域为387～1 008[15]。Rag1蛋白大部分生化和结构表征都是在核心区域，非核心区域包括1个与RING-锌指(RING-ZnF)域相邻的N末端域(N-terminal domain，NTD)和一个C末端尾巴(C-terminal tail，CTT)[16]，末端的CTT约含有30个氨基酸[17]。本例患儿在第3 074位基因重复突变，突变导致其编码蛋白1 025位的氨基酸由亮氨酸变成苯丙氨酸，这一基因突变虽然为纯合子突变，但该突变并未导致RAG1编码蛋白质的核心区域改变，改变位于CTT部，故其编码产物Rag1蛋白形成的复合物仍能保留低水平的重组酶活性，未导致病情更为严重的SCID或Omenn综合征。

2.3 RAG突变导致患者免疫功能异常的机制

在胎儿期胸腺细胞发育过程中，RAG表达在CD4-CD8-双阴性(double negative，DN)和CD4+CD8+双阳性(double positive，DP)阶段都发挥重要作用，而在B细胞发育的两个阶段亦有相似地表达。RAG的表达异常导致T淋巴细胞、B淋巴细胞的发育受阻[18]；它可导致T细胞库多样性和组成异常，多样性转化减少导致识别非自身抗原的能力受损，从而导致机体对感染的敏感性增加[3]；RAG缺乏症影响B细胞发育和体内平衡，循环中的B细胞数量大大减少[19]。在RAG缺陷患者中可观察到胸腺结构异常[20]。故此类患者容易受到低毒力的条件致病源感染，甚至出现致死性严重感染。

2.4 早期诊治CID的重要性

脐血干细胞移植(umbilical cord blood stem cell transplantation，UCBT)是治疗RAG突变免疫缺陷儿童的有效方法。尽早接受移植可以提高SCID患儿存活率，在接受移植的免疫缺陷儿童中，移植时年龄小于3.5个月的，其5年生存率为94%，而移植前感染和移植时年龄>3.5个月的儿童则为50%[21]。临床上CID的发病率不高，临床医生常常忽视它，因而错过治疗时机。对反复感染、严重感染、特殊病原体、常规治疗效果差、慢性腹泻、生长迟缓和(或)有早死家族史的儿童，应及早进行临床免疫功能评价，必要时行基因检测。早诊断、早移植对提高免疫缺陷儿童的存活率，改善儿童生活质量，指导优生优育都具有重要意义。