HPLC法测定动物源食品中6种抗生素残留

朱 虹

（河北化工医药职业技术学院，河北石家庄 050026）

动物源食品中的抗生素残留主要是由于动物在饲养过程中不可避免地使用抗生素而造成的，人们若长期摄入抗生素残留的食物，会导致抗生素在体内积蓄，使人们产生毒性和抗药性等一系列健康问题[1-2]。因此，建立快速、简单、低成本的动物源食品中抗生素残留的检测方法具有重要意义。

目前，抗生素同时检测使用比较多的方法是液质联用法[3-4]，但此方法对仪器设备要求高，价格昂贵，难以达到普及的程度。高效液相色谱仪（HPLC）普及率较高，具有分析检测速度快、灵敏度高等优点。因此，本文建立了HPLC法测定动物源食品中阿莫西林、土霉素、四环素、甲砜霉素、氟苯尼考和氯霉素6种抗生素残留的新方法。

1 材料与方法

1.1 仪器

LC-20A高效液相色谱仪，SPD-M20A二极管阵列检测器（日本岛津）；ZD-2 pH计（上海雷磁）；ATY124电子天平（日本岛津）；KS-3200E超声波清洗器（昆山市洁力美超声仪器有限公司）；800B离心机（上海安亭科学仪器厂）；XH-B旋涡混合器（天翎仪器）；HN200氮吹仪（海能仪器）。

1.2 试剂

标准品：甲砜霉素购自上海阿拉丁公司；阿莫西林和氟苯尼考购自上海吉至生化科技有限公司；土霉素、四环素和氯霉素购自上海源叶生物科技公司；甲醇（色谱纯）；乙腈（色谱纯）；甲酸、EDTA、正己烷等试剂均为分析纯。

1.3 试验方法

1.3.1 标准储备液的配制

分别称取一定量的抗生素标准品，用乙腈-水（4∶1，V/V）溶解，制备成1 mg/mL的标准储备溶液，-20 ℃避光密封保存。

1.3.2 样品前处理

称取1.5 g剁碎并匀质后的样品于50 mL离心管中，加入10 mL乙腈-水-0.1 mol/L EDTA溶液（15∶4∶1，V/V/V），涡旋振荡3 min，4 000 r/min 离心5 min，转移上清液于另一50 mL离心管中，加入5 mL乙腈饱和的正己烷溶液，涡旋振荡5 min，静置3 min，弃去正己烷层，将提取液转移至氮吹仪用管中进行氮吹浓缩，再用流动相初始比例复溶，0.22 µm滤膜过滤，待测。

1.3.3 色谱条件

色 谱 柱：Agilent ZORBAX SB-C18,5 µm，4.6 mm×250 mm；流动相：乙腈-甲酸溶液（pH2.50）在0～3 min内为18∶82（V/V），在3～15 min内变为33∶67（V/V）；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：20 µL。

2 结果与分析

2.1 6种抗生素分离色谱图

采用液相色谱仪（二极管检测器）检测6种抗生素，结果表明，12 min内其可对6种抗生素进行分离检测，且分离效果良好。6种抗生素分离色谱图，如图1所示。

图1 6种抗生素分离色谱图

2.2 样品前处理

在动物源性食品中抗生素残留检测中，乙腈是应用最多的提取剂[5]，乙腈-水体系对各类型的兽用抗生素都有较好的溶解能力且具有沉淀蛋白的作用。另外，EDTA可防止四环素、土霉素与样品中的重金属发生络合，所以在乙腈-水体系中加入了EDTA溶液。当乙腈-水-0.1 mol/L EDTA溶液为15∶4∶1（V/V/V）时，提取效果最佳，杂质干扰较小，回收率较高。

2.3 色谱条件的优化

选取了甲醇体系和乙腈体系作为流动相，研究发现，甲醇体系分离效果不好，且运行时间较长，而乙腈-甲酸体系经过优化能在比较短的时间内将6种抗生素进行分离，最终选取乙腈-甲酸体系作为流动相。

2.4 甲酸溶液pH值的选择

本文选取pH值为2.0、2.5、 3.0、3.5和4.0的甲酸溶液进行试验，试验结果表明，当甲酸溶液的pH为2.5时，6种抗生素的分离效果最佳。

2.5 不同柱温对样品峰型的影响

本文考察了25 ℃、30 ℃、35 ℃和40 ℃这4种柱温对6种抗生素分离的影响，结果表明，随着柱温的升高，色谱峰的出峰时间整体缩短，但土霉素和四环素分离效果变差。当柱温为30 ℃时，6种抗生素整体分离效果较好，出峰时间适合且峰形较好。

2.6 回归分析及检出限

量取一定量的标准储备液，按照1.3.3的流动相初始比例分别将其稀释成25 ng/mL、30 ng/mL、40 ng/mL、60 ng/mL、80 ng/mL和100 ng/mL的标准工作液，利用HPLC由低浓度到高浓度依次进行测定，每个浓度重复测定3次，以平均峰面积值为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。以3倍信噪比（S/N）所对应的浓度为检出限（LOD），以10倍信噪比（S/N）所对应的浓度为定量限（LOD），结果见表1。由表1可知，6种抗生素在25～100 µg/kg，6种抗生素的线性关系良好，相关系数均大于0.999，检出限为8～9 µg/kg，定量限为 27 ～ 30 µg/kg。

表1 6种抗生素线性方程、线性范围、相关系数、检出限和定量限

2.7 加标回收率

称取1 g空白样品，添加适量混合标准储备液，制成40 µg/kg的空白添加样品，按照1.3.2法处理后，进行测定，结果见表2。由表2可知，样品的加标回收率为84.8%～91.2%，相对标准偏差为3.2%～4.3%。表明方法稳定且重现性好。

表2 加标回收率结果

3 结论

本研究通过对肉源性食品中阿莫西林、土霉素、四环素、甲砜霉素、氟苯尼考和氯霉素6种抗生素的提取优化和检测方法的优化，实现了12 min内梯度分离6种抗生素，且该方法操作简单，快速高效，可为肉源性食品中多抗生素残留的检测提供参考依据。