EphA2受体及其配体EphrinA1在乳腺癌中的表达及意义

陈波,李庄,张本斯(.湖南师范大学附属湘东医院,湖南 株洲 400;.大理大学第一附属医院,云南 大理 67000;.大理大学基础医学院,云南 大理 67000）

近年来，随着分子生物学、遗传学、免疫学、生物技术等学科的发展，我国在对乳腺癌的临床研究上取得了巨大的发展，对乳腺癌生物学标志物的研究达几十种之多，并且还在不断增加，如ER、PR、HER-2、CD44、P53、Ki67、muc-1、mdrl等，其中研究较为深入的为HER-2、ER、PR，并且在对乳腺癌的治疗及预后评价中应用最多。但是其特异性以及敏感性仍然不够理想，所以，寻找一个对乳腺癌更具有特异性及敏感性的分子标志物显得尤为迫切。

表l EphA2蛋白在乳腺癌中的表达与临床病理因素的关系

而近年来Eph（erythropoitin producing hepatocellular carcinoma）受体家族被发现与多种恶性肿瘤的发生、转移及血管生成相关，可作为潜在的肿瘤分子标志物及治疗靶点[1-4]。在乳腺癌中，Eph/ephrin信号同样具有促进肿瘤进展和血管生成、调节肿瘤干细胞稳态、抑制肿瘤发展等多面作用，且Eph/ephrin表达谱与乳腺癌患者的临床结果相关[5-7]。

本研究主要通过免疫组化的方法来检测乳腺癌中EphA2受体及配体EphrinA1的表达情况。并且通过统计学方法来探讨乳腺癌中EphA2受体及其配体EphrinA1的表达与临床病理因素的关系，以期对乳腺癌的治疗和预后提供一个新的思路。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 临床资料和组织样本 选取云南省大理大学附属医院93例术前未行放疗、化疗或其他特殊治疗的各民族女性乳腺癌手术切除标本及病人的临床病例信息。所选患者的临床资料包括年龄、肿瘤大小、病理类型、临床分期、淋巴结转移和组织学分级等。所取肿瘤标本的病理类型、淋巴结转移和组织学分级等病理参数均来自于病理报告。

1.1.2 主要试剂与仪器 EphA2兔/羊抗人多克隆抗体（adcam公司），EphrinA1兔抗人多克隆抗体（invitrogen公司），SP免疫组化试剂盒（SP9710）(福州迈新生物技术有限公司），DAB显色剂（福州迈新生物技术有限公司），石蜡切片机（MICROM公司），光学显微镜（OLYMPUS公司）。

1.2 方法

1.2.1 病理切片的制作 我们将含有肿瘤组织的蜡块重新包埋后，由病理科技术人员以5μm的厚度连续切片，每个蜡块切片10张，并且将每个蜡块切成的10张切片分成两等份，其中5张切片上用铅笔写上EphA2作为标记，另外5张切片用铅笔写上EphrinA1作为标记。

1.2.2 基本步骤分为：组织切片、水化、封闭内源性过氧化物酶—修复抗原并暴露抗原决定簇—封闭特异性蛋白—加入一抗、二抗进行孵育、SP反应—显色剂—苏木精复染、脱水、封片—光学显微镜下观察。设置两组对照组：以PBS缓冲液代替一抗及二抗，设置对照组。

1.3 结果判定 每例切片随机选择5个高倍镜视野，计数500个以上细胞，根据着色细胞占肿瘤细胞数的比例来分为(-)和(+)。EphA2蛋白：细胞膜和细胞浆同时染成棕黄色或棕褐色的细胞，每5个高倍视野＞20%者为阳性，否则为阴性病例。EphrinA1蛋白：细胞膜和细胞浆同时染成棕黄色或棕褐色的细胞，每5个高倍视野＞10%者为阳性着色，否则为阴性。结果判断均由两名高年资病理科医生统一核准。

1.4 统计分析 应用SPSS统计软件分析，样本率的比较采用χ2检验（当有1个格子的理论数小于5时，采用Continuity Correction法，当有1个格子的理论数小于1或者1/5以上格子的理论数小于5时，采用Fisher’s Exact test法，其余均采用Pearson（Chi-Square）法）；相关联性分析采用χ2检验，检验标准均取P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 EphA2蛋白在乳腺癌标本中的表达情况 在所选取的93例乳腺癌标本中，EphA2蛋白的阳性表达为74例，阳性表达率为79.57%。见图1、图2。

图1 EphA2在乳腺癌中的阳性表达(SP×200)

图2 EphA2在乳腺癌中的阳性表达(SP×400)

2.2 EphA2蛋白在乳腺癌的阳性表达率与乳腺癌患者的年龄、肿瘤大小、临床分期、淋巴结转移和组织学分级的关系 据表1分析，EphA2蛋白在细胞内的表达与患者年龄、肿瘤大小、病理类型、TNM分期无显著差异（P＞0.05），而与淋巴结转移、肿瘤的组织学分级相关（P＜0.05），组织学分级越高，EphA2蛋白在下乳腺癌细胞内阳性表达所占的比例越高。

在所选取的93例乳腺癌标本中，EphrinA1蛋白的阳性表达为70例，阳性表达率为75.27%。见图3、图4。

图3 EphrinA1在乳腺癌中的阳性表达(SP×200)

图4 EphrinA1在乳腺癌中的阳性表达(SP×400)

2.3 EphrinAl蛋白在乳腺癌的阳性表达率与乳腺癌患者的年龄、肿瘤大小、临床分期、淋巴结转移和组织学分级的关系 据表2分析，EphrinA1蛋白在细胞内的表达和EphA2蛋白在细胞内的表达非常相似，与患者年龄、肿瘤大小、病理类型、TNM分期无显著差异（P＞0.05），而与淋巴结转移、肿瘤的组织学分级相关（P＜0.05），并且组织学分级越高，EphrinA1蛋白在下乳腺癌细胞内阳性表达所占的比例越高。通过表1与表2的综合分析，说明EphA2蛋白与EphrinA1蛋白在细胞内的表达有非常紧密的联系。据表3分析，EphA2蛋白与EphrinA1蛋白之间无显著差异（P＞0.05），说明EphA2和EphrinA1之间存在相关性。有文献报道，EphA2在细胞内的表达可以作用于EphrinA1，促进其在细胞内的表达。

表2 EphrinA1蛋白在乳腺癌中的表达与临床病理因素的关系

表3 乳腺癌中EphA2的表达与EphrinA1表达的关系

3 讨论

即使乳腺癌患者有着相同的临床分期、相同的病理类型、相同的组织学分级，经过相同方案的手术治疗以及相同的放化疗方案，但其预后仍然存在较大的差异，说明个体的差异性对乳腺癌的预后影响很大。随着现代分子生物学的高速发展，医学研究已经进入分子水平时代，传统的病理组织学分类已经不能满足现代医学的研究及发展。寻找出能够帮助乳腺癌诊治及预后的分子生物学已经成为目前研究的热点之一。

EphrinA1是第一个被发现的Eph受体亚家族的配体。很多研究表明，Eph家族与肿瘤的发生发展有着密切的联系，而Eph家族也越来越受到关注。

许多国外学者研究发现，EphA2和EphrinA1在乳腺癌中的高表达与乳腺癌的进展有关，EphA2与EphrinA1的表达随乳腺癌恶性程度的增高而逐渐增加，并且与乳腺癌患者的生存状态有关。

EphA2受体与EphrinA1配体之间的多种交叉结合，以及与其他因子的相互作用，还有在不同细胞里的表达情况，使得其在乳腺癌的发生发展中起到的作用非常复杂，关于它在乳腺癌中的作用机制尚不明确，它也受到了国内外越来越多的学者的重视，对其的研究也越来越多，相信不久的将来，其能够成为肿瘤分子水平治疗的新靶点。

4 结论

本研究发现，EphA2蛋白和EphrinA1蛋白共同表达于乳腺癌组织中，且与其乳腺癌的淋巴结转移、组织学分级相关，而乳腺癌的淋巴结转移和组织学分级又对其治疗和预后有着很重要的影响。所以EphA2蛋白和EphrinA1蛋白有望作为乳腺癌恶性程度及预后的一个指标，也能对乳腺癌的早期诊治及预后提供帮助。

综上所述，EphA2蛋白及EphrinA1蛋白的检测可以作为一个指标来指导乳腺癌的临床治疗以及用来评估患者的预后。但是乳腺癌是一个由多因素引起的疾病，我们需结合其他因素及指标来综合判断与分析，才能为乳腺癌的治疗开辟一条新的大道。