时钟基因Rev-erbα对心肌缺血再灌注损伤保护机制的研究进展

田浩，张艺，熊永红，夏中元

(武汉大学人民医院麻醉科，武汉 430060)

心血管疾病是21世纪影响人类健康的首要问题，《中国心血管健康与疾病报告2019》[1]显示：中国有大约3.3亿心血管疾病患者，其中冠心病患者1 100万。包括冠心病在内的一系列缺血性心脏疾病的防治一直是临床研究的重点。恢复血液循环是缺血性心肌病治疗的关键，临床上采取各种措施来疏通梗阻的血管，以保障心肌有效的血液供应。然而心肌在恢复血供后往往会出现损伤加重的现象，即心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)。目前，MIRI的发生机制仍未完全明确，普遍认为再灌注时氧自由基爆发、钙超载、腺苷三磷酸(adenosine triphosphate，ATP)能量代谢障碍、细胞自噬、细胞铁死亡、炎症、血管内皮细胞功能障碍等是缺血再灌注损伤病理过程发生发展的重要原因[2]。近年来，时钟基因Rev-erbα在MIRI中的相关保护机制研究逐渐增多[3-4]，因而人们对缺血性心脏疾病的防治也有了新的认识。时钟基因Rev-erbα是核受体超家族的成员，涉及许多生理和病理过程的调控，如睡眠障碍、能量代谢。近年来关于时钟基因与人类疾病关系的研究不断增多，据相关研究报道，时钟基因Rev-erbα参与糖尿病心脏病、动脉粥样硬化、心肌肥大等心血管疾病的病理生理进程[5-6]。现就Rev-erbα在MIRI保护机制中的相关研究进展予以综述，以期为缺血性心脏疾病的防治提供新思路。

1 昼夜节律与Rev-erbα

1.1昼夜节律 大多数生物通过光线、温度和食物等来预测生存环境的日常变化，以获得对其最佳的适应性。在动物、植物、真菌和细菌中观察到显著的日常行为和生理节律，这些节律被称为昼夜节律，是昼夜节律生物钟的自主内在计时系统的外在表现[7]。

昼夜节律计时系统由位于下丘脑视交叉上核的中枢生物钟以及全身其他脑区和器官组织(包括肌肉、脂肪组织和肝脏)的外围生物钟组成[8]。视交叉上核包含大约20 000个神经元，每个神经元均被认为包含一个细胞自主昼夜节律振荡器。视交叉上核神经元通过与视网膜的直接突触连接来接收有关环境光强度的信息，从而使视交叉上核振荡器的相位适应光周期。此外，视交叉上核通过神经、内分泌、温度和摄食行为等信号同步外围生物钟。

分子水平上，昼夜节律由两个连锁的转录/翻译反馈环产生，这两个反馈环共同作用，从而产生24 h基因表达节律。核心转录/翻译反馈环由4种完整的时钟蛋白驱动：两种激动剂昼夜节律运动输出周期故障(circadian locomotor output cycles kaput，Clock)和脑和肌肉芳香烃受体核转运样蛋白1(brain and muscle ARNT-like protein 1，Bmal1)及两种阻遏剂周期蛋白(period，Per)和隐花色素蛋白(cryptochrome，Cry)。Clock和Bmal1是碱性螺旋环-螺旋-周期蛋白-芳香烃受体核转运蛋白-类泛素蛋白相互作用基序结构域中异二聚体复合物Clock/Bmal1的亚单位，复合物Clock/Bmal1通过与调控基因中的E-box元件结合来激活Per和Cry基因以及其他下游基因的转录[9]。Per和Cry蛋白在细胞质中异二聚化，并转移到细胞核中与Clock/Bmal1相互作用，从而抑制其进一步转录激活。当Per和Cry蛋白通过泛素依赖性途径降解时，它们对Clock/Bmal1的抑制被解除，循环以24 h周期再次开始[10]。第二个转录/翻译反馈环是通过视黄酸相关孤儿受体(α、β、γ)的转录激活和Rev-erbα/Rev-erbβ的抑制产生。转录/翻译反馈环驱动Bmal1转录的节律性变化，并导致Cry1基因表达延迟，从而使其与由Clock/Bmal1严格调控的基因相抵消[11]。协同、连锁反馈回路的存在有助于保持准确的昼夜节律时间，也有助于在昼夜节律转录输出中产生相位延迟。

1.2Rev-erbα Rev-erb亚家族包含两个成员：Rev-erbα(也称NR1D1)和Rev-erbβ(也称NR1D2)[12]。Rev-erbα于1989年被发现，并定位到编码另一个核受体甲状腺激素受体α基因的反向链上，其结构与甲状腺激素受体和视黄酸受体最相似，但不结合甲状腺激素或视黄酸。与配体调节的核受体相反，Rev-erbα缺少配体结合域C端激活螺旋-H12，因而是一种孤儿核受体[13]。Rev-erbα显示出一个疏水区域，在该区域招募了如核受体共抑制因子的共阻遏物。Rev-erbα通过与核受体共抑制因子结合而发挥显性转录沉默子的作用。因此，Rev-erbα常充当转录的组成型阻遏物。

在哺乳动物中，Bmal1和Clock激活Cry和Per基因的转录。Per和Cry蛋白一旦达到临界浓度就会通过翻译后调节抑制自身的合成[14]。而Rev-erbα的转录被Bmal1-Clock异二聚体激活，同时也被Cry和Per蛋白抑制，导致Rev-erbα基因表达的昼夜节律振荡。反过来，Rev-erbα抑制Bmal1和Clock基因的表达，反馈回路的正负分支也因此衔接起来。Rev-erbα反馈调节核心时钟成分Bmal1的转录，以稳定昼夜节律振荡。此外，Rev-erbα在其他分子钟调节器的节律方面也具有转录抑制作用，包括Clock、Cry1、白细胞介素-3调节相关转录因子和神经PAS域蛋白2等[15]。因此，Rev-erbα作为分子钟的整合者，具有通过与多个基因的调控相互作用改变整体细胞振荡的潜力。

2 Rev-erbα在MIRI中的作用

许多疾病的症状和发病模式在24 h内并非随机分布，往往伴有一定的昼夜节律性。Muller等[16]将血浆肌酸激酶水平首次升高的时间作为客观确定心肌梗死的发作时间，观察发现与23:00相比，9：00点心肌梗死的发作频率增加了3倍，证实了心肌梗死发作昼夜节律的存在。据报道，在动物实验[17]和临床试验[18]中，昼夜节律可调节心肌细胞对缺血再灌注损伤的耐受性。在睡眠-觉醒转换时通过抑制 Rev-erbα活性可以赋予心肌缺氧-复氧耐受性，改善MIRI[18]。近年相关研究发现，在炎症反应[4]、自噬[19]、氧化应激[20]以及代谢[3]等机制方面通过调控时钟基因Rev-erbα可起到一定的心肌保护作用。药物和缺血预处理是目前治疗MIRI的主要方法。虽已证实了各种缺血预处理手段的安全性，但由于临床效果不同，还需进一步临床试验[21]。目前临床上使用的药物大多是针对MIRI的发生机制，减轻炎症反应，减少氧自由基、自噬及改善内皮功能等[22]。因此，探索时钟基因Rev-erbα与MIRI之间的潜在联系可为缺血性心脏疾病的治疗提供新方向。

2.1Rev-erbα与炎症反应 心肌细胞缺血坏死触发强烈的炎症级联反应，其功能是清除受损心肌中死亡的细胞，并为激活修复过程奠定基础。及时抑制炎症反应并在空间上遏制炎症反应对防止损伤的扩大尤为必要，过度活跃甚至失调的炎症反应可能导致心肌细胞死亡[23]。

缺血再灌注的缺血期与基因表达的转录控制显著改变有关。由于需要氧作为辅助因子，缺血可引起氧敏感脯氨酰羟化酶的抑制。脯氨酰羟化酶的抑制导致核因子κB的活化，有助于限制细胞凋亡[24]。核因子κB的经典途径能够调节炎症，协调免疫反应和组织稳态。其中IκB激酶β途径与脯氨酰羟化酶-缺氧诱导因子途径的成员相互作用，将炎症与缺氧联系起来[25]。对炎性肠病小鼠模型的研究表明，肠炎症中脯氨酰羟化酶可调节核因子κB介导的抗凋亡作用[26]。此外，肠缺血再灌注时肠上皮细胞中的核因子κB被激活，进而增加肿瘤坏死因子-α的产生，但同时减弱肠上皮细胞凋亡。一项关于血管平滑肌细胞的研究表明，Rev-erbα可增强肿瘤坏死因子-α诱导的核因子κB的激活，进而上调炎症标志物(如白细胞介素-6、环加氧酶-2)的表达[27]，可见Rev-erbα与核因子κB通路之间存在调节关系。因此，通过介导时钟基因Rev-erbα及其相关免疫反应，抑制细胞凋亡有望成为MIRI的治疗策略。

2.2Rev-erbα与细胞自噬 自噬普遍存在于缺血、功能衰竭和衰老的心肌中，可以回收受损的细胞器，提供细胞营养，维持基础体内平衡[28]。自噬是指机体通过特定机制调节细胞内成分的有序降解和再生循环，并以双层膜结构包裹部分胞质和细胞器的自噬小体为特异性指标。研究发现，自噬激活现象存在于心肌梗死后存活的心肌细胞中，透射显微镜下可观察到自噬小体[29]。而应用哺乳动物雷帕霉素增强自噬水平后，心肌重塑减轻，心脏功能恢复。

自噬在MIRI中处于关键地位[30]。心肌缺血期时，自噬水平的增强使细胞内受损细胞器得到清理，这可能是机体在心肌缺血过程中的一种自我保护；而再灌注期时，自噬水平过度激活，诱发细胞程序性死亡，从而加重心肌损伤。因此，自噬在MIRI的不同时期发挥不同的作用。而Pastore和Ballabio[31]发现伴随Rev-erbα的敲除，自噬基因和自噬流量的表达增强。据报道，经过Rev-erbα激动剂SR9009处理后，自噬相关基因表达减少，证实Rev-erbα的激活可以通过调节自噬相关通路来保护肠道屏障功能[32]。同样，Shen等[19]也发现SR9009治疗小细胞肺癌的作用是通过Rev-erbα依赖的自噬抑制介导。以上研究表明，时钟基因Rev-erbα参与调控细胞自噬，提示可通过调控Rev-erbα的表达水平，减少细胞过度自噬，改善MIRI。

Song等[34]发现将大鼠及其后代暴露于环境空气颗粒会导致Rev-erbα表达水平降低，同时肺组织和全身氧化应激水平显著升高。此外，Sengupta等[20]研究表明，Rev-erbα通过增强线粒体功能维持细胞代谢来控制细胞内环境稳定，从而提高机体对氧化应激的耐受性。同时Rev-erbα的稳定化可以增加线粒体活性氧类，而线粒体活性氧类对细胞具有保护作用，与缺血再灌注损伤密切相关[35]。综上，Rev-erbα在抗氧化防御系统中发挥重要作用，推测可以时钟基因Rev-erbα作为靶点来对抗氧化应激，改善MIRI。

2.4Rev-erbα与代谢异常 能量代谢障碍被认为是缺血再灌注损伤发生的重要环节，而线粒体被视为细胞的动力源，以ATP的形式产生能量。因此，线粒体数量和功能的改变与能量代谢有直接联系。Rev-erbα以代谢物血红素为内源性配体，可参与线粒体呼吸和细胞氧化还原平衡，且在联系新陈代谢与昼夜节律中扮演重要角色[36]。因此，Rev-erbα可作为细胞代谢状态的传感器，将生物时钟与代谢平衡密切联系起来。当心肌细胞缺氧时，心肌能量代谢发生改变，糖酵解产生的ATP逐渐成为维持心肌细胞存活的唯一能量来源，但糖酵解产生的ATP远不能满足心肌细胞的需求，同时过度的脂肪酸β氧化使得耗氧增加，最终加重心肌细胞损伤。

据报道，Rev-erbα的稳定化可以增强成纤维细胞的线粒体呼吸[20]。相反，过表达的Rev-erbα能以血红素依赖性的方式限制肝癌细胞中线粒体的呼吸作用。Woldt等[37]发现，体外Rev-erbα的过表达增加了线粒体的数量，而体内肌肉中Rev-erbα的过表达或药理激活增加了运动能力。以上研究表明，Rev-erbα在调节线粒体数量和功能中起重要作用。因此，Rev-erbα可能通过调节能量代谢影响MIRI的重要过程，但具体机制仍未阐明。

2.5Rev-erbα与其他 纤溶酶原激活物抑制剂-1(plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1)是纤维蛋白溶解的主要抑制剂，可在脂肪组织中表达，并呈现昼夜表达模式。研究表明，Rev-erbα通过PAI-1启动子中的两个Rev-erbα结合位点抑制人PAI-1基因表达[38]。PAI-1转基因小鼠会出现自发性的年龄依赖性冠状动脉血栓形成[39]。有证据表明，PAI-1水平的升高可能促进动脉粥样硬化血栓形成的发展[40]。因此，通过调控Rev-erbα可以改善心血管凝血功能。

心肌缺血再灌注时，大量的活性氧类由内皮细胞产生，且抗氧化活性也大大降低，当大量的活性氧类超过内皮细胞的防御系统能力可导致心肌细胞损伤。一氧化氮是一种由内皮细胞产生的强大扩血管物质，且具有抑制血小板和白细胞黏附、限制平滑肌细胞增殖的作用，因此在MIRI中具有重要保护作用。血管内皮一氧化氮依赖性血管舒张功能下降可导致内皮细胞更易受氧自由基的损害，从而加重MIRI易损性。有研究表明，Rev-erbα是一氧化氮的直接靶点，且其介导的转录抑制可被一氧化氮逆转[41]。啮齿类动物的肺动脉高压模型证明，一氧化碳诱导内皮细胞产生一氧化氮，并最终促进正常动脉和血管大小的恢复[42]。另一项研究表明，一氧化碳可增加缺血再灌注损伤时大鼠心脏组织中蛋白激酶B的表达[43]。蛋白激酶B是一种对细胞存活和代谢至关重要的丝氨酸-苏氨酸激酶，而蛋白激酶B的磷酸化与Rev-erbα表达呈负相关[6]，因此推测Rev-erbα与双原子气体一氧化碳和一氧化氮之间形成了调控环路，通过改善血管的舒张功能影响MIRI。综上，当时钟基因Rev-erbα受到干扰时可能会引发内皮功能障碍和血栓形成的状态，最终加重MIRI。

3 小 结

昼夜节律的紊乱与多种疾病的发生发展密切相关，其中时钟基因Rev-erbα是昼夜节律的一个重要组成部分。Rev-erbα在多个组织中表现出强烈的昼夜节律振荡，且在代谢、免疫、炎症等方面有重要影响，因此成为近年的研究热点。目前MIRI的病理机制仍未完全阐明，且缺乏有效的防治措施，而通过调节时钟基因Rev-erbα在氧化应激、细胞自噬、炎症反应等方面的作用，可以限制MIRI的易损性增加，进而起到一定的心脏保护作用。事实上，在某些情况下调节Rev-erbα也可以导致其他疾病病情的改善，如阿尔茨海默病、高同型半胱氨酸血症和高胆固醇血症等[44-46]。因此，未来时钟基因有望作为一个新的干预靶点，成为一种安全性高和成本低廉的治疗选择。