TRB3沉默对氧糖剥夺/再灌注诱导的大鼠脊髓星形胶质细胞损伤的影响

徐汪洋，王业杨，张辉，黄丽珊

广东省第二人民医院骨科中心，广州 515000

脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)是一种破坏性的创伤[1]，可导致神经功能缺损[2]、瘫痪，甚至死亡[3]。星形胶质细胞是中枢神经系统中一类重要的胶质细胞，对保护中枢神经系统中的神经元非常重要[4-5]，成为近年来SCI修复的研究热点[6]。Tribbles同源蛋白3(Tribbles homologue 3，TRB3)是一种细胞转录调控因子，参与调控细胞增殖、分化和凋亡，与机体炎症反应、氧化应激和肿瘤代谢等多种过程密切相关[7]。研究发现，TRB3表达下调对全脑缺血再灌注损伤所致大鼠神经元凋亡具有保护作用[8-9]，但目前其对SCI的作用研究较少。本研究旨在探讨TRB3对氧糖剥夺/再灌注(oxygen-glucose deprivation/reoxygenation，OGD/R)诱导的大鼠脊髓星形胶质细胞损伤的影响，以为治疗SCI引起的星形胶质细胞损伤及多种炎症反应提供靶点。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 D M E M/F 1 2 培养基、胎牛血清(美国Gibco公司)；TRB3 shRNA慢病毒(上海GenePharma公司)；CCK-8试剂盒(江苏凯基生物技术股份有限公司)；乳酸脱氢酶(l a c t i c dehydrogenase，LDH)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)试剂盒(南京建成生物工程研究所)；肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白细胞介素-1β(interleukin-1，IL-1β) ELISA试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)；Annexin V-FITC/PI试剂盒(上海翊圣生物科技有限公司)；Trizol试剂、Revert Aid第一链cDNA synthesis反转录试剂盒(日本TaKaRa公司)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天生物技术研究所)；ECL化学发光试剂、PVDF膜(美国Millipore公司)；细胞核蛋白提取试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)；抗TRB3抗体、抗核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)抗体、抗β-actin兔克隆抗体、抗GFAP抗体(英国Abcam公司)；HRP标记的山羊抗兔IgG、FITC标记的羊抗兔IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司)；白桦脂酸(betulinic acid，BA) (美国MedChemExpress公司)。

1.2 大鼠星形胶质细胞的分离培养和鉴定 新生SD雄性大鼠20只，由广东省医学实验动物中心提供[实验动物许可证号：SYXK(粤)2013-0011]。本研究通过广东省第二人民医院医学伦理委员会审批(20200622-GZSKJ-14)，实验过程符合国家和单位有关实验动物的管理和使用规定。参照Liu等[10]的方法，从新生2 d的SD大鼠中分离培养脊髓星形胶质细胞。无菌条件下剖开大鼠椎管，小心剥离脊膜和血管，分离出脊髓组织，剪成细小碎块，加入0.125%胰蛋白酶反复消化，然后加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液终止消化，用200目筛网过滤后制成细胞悬液。细胞以1×105个/cm2密度接种于培养瓶中，于37 ℃、5% CO2条件下培养，每2 d换液1次，至第9天细胞基本融合成片，换液后于37 ℃摇床上240 r/min振荡培养24 h，弃上清(主要是小胶质细胞和少突胶质细胞)，每2 d振荡1次，重复2次。收集贴壁细胞，PBS洗涤，加入新鲜培养液继续培养1 d，经胰蛋白酶消化传代，取生长状态良好的第3代细胞，采用GFAP免疫荧光法进行鉴定，纯度超过90%可用于后续实验。

1.3 GFAP免疫荧光法鉴定大鼠星形胶质细胞 分离培养的大鼠星形胶质细胞进行细胞爬片，培养24 h，弃掉培养液，PBS洗涤1次；用4%多聚甲醛溶液固定20 min，PBS洗涤3次；用5% BSA室温下封闭2 h，加入GFAP一抗(1:500)4 ℃孵育过夜；次日PBS洗涤3次，滴加FITC标记的羊抗兔IgG(1:200)室温孵育2 h；洗涤后加入DAPI室温孵育20 min，对细胞核进行染色。洗涤后于激光共聚焦显微镜下观察并拍照。

1.4 TRB3 shRNA慢病毒感染细胞及分组 将脊髓星形胶质细胞分为对照组(不做任何处理)、Scramble组(感染阴性对照慢病毒)与shTRB3组(感染TRB3 shRNA慢病毒)。将细胞于6孔板中培养，待融合度达50%时，根据慢病毒使用说明书对细胞进行感染，步骤如下：吸出孔内培养基，添加感染复数(multiplicity of infection，MOI)为20的慢病毒，继续培养12 h。次日更换培养基，继续培养48 h，收集细胞总RNA及总蛋白，采用Real-time PCR及Western blotting检测各组细胞中TRB3 mRNA及蛋白水平，确定TRB3 shRNA慢病毒干扰效率。

1.5 OGD/R细胞模型建立及分组 参照Sun等[11]的方法建立脊髓星形胶质细胞OGD/R模型。细胞用PBS洗涤后，于1% O2、5% CO2、37 ℃无糖DMEM/F12培养基中培养6 h，然后于正常条件下在正常培养基中培养24 h进行相关实验检测。

将细胞分为对照组(正常培养)、OGD/R组(进行OGD/R处理)、shTRB3组(感染TRB3 shRNA慢病毒)、Scramble组(感染阴性对照慢病毒)、OGD/R+shTRB3组(感染TRB3 shRNA慢病毒后，进行OGD/R处理)与OGD/R+Scramble组(感染阴性对照慢病毒后，进行OGD/R处理)。对于BA处理实验，OGD/R组和OGD/R+shTRB3组细胞在1% O2、5%CO2、37 ℃的无糖DMEM/F12培养基中培养6h后，加入20 μmol/L BA继续培养24 h。

1.5.1 流式细胞术检测细胞凋亡情况 收集各组细胞并调整细胞密度至1×106个/ml，用预冷的PBS洗涤3次，加入300 μl结合缓冲液，按照试剂盒说明书步骤按顺序加入Annexin-V及PI，室温避光孵育5 min，采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.5.2 CCK-8法检测细胞活性 将脊髓星形胶质细胞接种于96孔板(1×105个/ml)中，于37 ℃、5%CO2培养箱中培养24 h，按照上述分组进行相应处理后，每孔加入10 μl CCK-8溶液继续培养2 h，于450 nm波长处测定吸光度值(OD)，每组3个复孔，实验至少重复3次。

1.5.3 细胞培养液LDH漏出率测定 收集各组细胞培养上清及细胞裂解物，用LDH活性检测试剂盒测定各组OD值，具体参照试剂盒说明书步骤操作，重复3次。细胞培养液LDH漏出率(%)=培养液OD值/(培养液OD值+细胞匀浆液OD值)×100%。

1.5.4 SOD活性、MDA含量测定 收集各组细胞培养上清，分别用黄嘌呤氧化酶法和硫代巴比妥酸法检测SOD活性和MDA含量，按照SOD、MDA试剂盒说明书步骤操作。

1.5.5 ELISA法检测炎性因子IL-1β和TNF-α水平收集各组细胞培养上清，用ELISA试剂盒检测炎性因子IL-1β和TNF-α的分泌量，具体按照试剂盒说明书步骤操作，重复3次。

1.5.6 Real-time PCR检测TRB3 mRNA相对表达量用Trizol提取细胞总RNA，反转录成cDNA，以cDNA为模板进行扩增，按照Revert Aid第一链cDNA synthesis反转录试剂盒说明书步骤操作。反应条件：90 ℃ 10 min；94 ℃变性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40个循环。以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCt法计算TRB3 mRNA相对表达量。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，序列如下：TRB3上游5'-TCCGTAGAGGGACCTTTGCC-3'，下游5'-CCTCAACCAGGGATGTAGCAG-3'；GAPDH上游5'-AGGTCGGTGTCAACGGATTT-3'，下游5'-CAGCATCAAAGGTGGAGGAA-3'。

1.5.7 Western blotting检测TRB3、NF-κB p65蛋白表达水平 收集各组细胞，PBS洗涤后，加入RIPA裂解液裂解细胞，提取总蛋白，用BCA法测定总蛋白浓度。对于细胞核NF-κB p65的检测，使用核蛋白提取试剂盒提取细胞核蛋白，并测定浓度。取20 μg总蛋白行SDS-PAGE电泳，转膜，5%脱脂奶粉封闭，加入相应一抗孵育。对于TRB3 shRNA慢病毒感染效率的检测，使用抗TRB3抗体(1:1000)孵育；对于细胞内NF-κB信号通路的检测，使用抗NF-κB p65抗体(1:500)孵育。洗膜后加入HRP标记的山羊抗兔IgG二抗(1:5000)孵育2 h。ECL化学发光法显影，ImageJ软件测定灰度值，以β-actin为内参，分析目的蛋白的相对表达量，每个样本重复3次。

1.6 统计学处理 采用SPSS 22.0软件进行统计分析。计量资料以表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 大鼠脊髓星形胶质细胞鉴定 光镜下观察显示，培养3 d时，脊髓星形胶质细胞主要呈梭形或星形，形状多不规则，细胞质丰富，细胞核大(图1)。随机选取5个视野，计数GFAP阳性细胞和总细胞，阳性细胞率达95%以上，可用于后续实验。

图1 纯化培养的大鼠脊髓星形胶质细胞GFAP荧光染色Fig.1 Purified and cultured astrocytes in rat spinal cord(GFAP fluorescence staining)

2.2 OGD/R处理对大鼠脊髓星形胶质细胞中TRB3表达的影响 与对照组比较，OGD/R组星形胶质细胞中TRB3 mRNA(2.15±0.12vs. 1.00±0.05)和蛋白(2.10±0.16vs. 1.00±0.08)表达水平升高，差异有统计学意义(P<0.05，图2)。

图2 OGD/R处理后大鼠脊髓星形胶质细胞中TRB3 mRNA和蛋白表达情况(n=3)Fig.2 The mRNA and protein expression levels of TRB3 in rat spinal astrocytes after OGD/R treatment (n=3)

2.3 TRB3沉默对OGD/R诱导的大鼠脊髓星形胶质细胞凋亡的影响 为进一步研究TRB3的作用，使用TRB3 shRNA慢病毒感染星形胶质细胞，并对TRB3 shRNA慢病毒干扰效率进行检测，结果显示，与对照组比较，Scramble组星形胶质细胞中TRB3 mRNA和蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05)，shTRB3组星形胶质细胞中TRB3 mRNA(0.30±0.07vs.1.00±0.10)和蛋白(0.30±0.04vs. 1.00±0.06)表达水平明显降低，差异有统计学意义(P<0.05，图3A、B)，表明TRB3 shRNA慢病毒感染成功。

流式细胞术检测结果显示， 与对照组(2.4%±0.2%)比较，Scramble组(3.2%±0.4%)和shTRB3组(3.5%±0.5%)星形胶质细胞凋亡率差异无统计学意义(P>0.05)，OGD/R组(24.9%±1.1%)、OGD/R+Scramble组(24.8%±1.5%)和OGD/R+shTRB3组(13.4%±0.2%)星形胶质细胞凋亡率明显增高，差异有统计学意义(P<0.05)；而OGD/R+shTRB3组星形胶质细胞凋亡率明显低于OGD/R组和OGD/R+Scramble组，差异有统计学意义(P<0.05，图3C)。

图3 TRB3沉默对OGD/R诱导的大鼠脊髓星形胶质细胞凋亡的影响(n=3)Fig.3 Effects of TRB3 silencing on the OGD/R-induced apoptosis in rat spinal astrocytes (n=3)

2.4 TRB3沉默对OGD/R诱导的大鼠星形胶质细胞活性、LDH漏出率、MDA含量及SOD活性的影响 与对照组比较，Scramble组和shTRB3组细胞活性、LDH漏出率、MDA含量、SOD活性差异无统计学意义(P>0.05)，OGD/R组、OGD/R+Scramble组和OGD/R+shTRB3组细胞活性、SOD活性明显降低，LDH漏出率、MDA含量明显增高，差异有统计学意义(P<0.05)；与OGD/R组和OGD/R+Scramble组比较，OGD/R+shTRB3组细胞活性、SOD活性明显升高，LDH漏出率、MDA含量明显降低，差异有统计学意义(P<0.05，表1)。

表1 TRB3沉默对OGD/R诱导的大鼠脊髓星形胶质细胞活性、LDH漏出率、MDA含量及SOD活性的影响(±s，n=6)Tab.1 Effects of TRB3 silencing on cell viability and LDH leakage rate, SOD activity and MDA content in OGD/R-induced rat spinal astrocytes (±s, n=6)

TRB3. Tribbles同源蛋白3；OGD/R. 氧糖剥夺/再灌注；LDH. 乳酸脱氢酶；MDA. 丙二醛；SOD. 超氧化物歧化酶；与对照组比较，(1)P<0.05；与Scramble组比较，(2)P<0.05；与shTRB3组比较，(3)P<0.05；与OGD/R组比较，(4)P<0.05；与OGD/R+Scramble组比较，(5)P<0.05。

组别细胞活性(%)LDH漏出率(%)MDA含量(nmol/ml)SOD活性(ng/ml)对照组100.0±6.216.53±0.602.15±0.172.97±0.11 Scramble组99.0±3.617.50±0.362.56±0.263.07±0.02 shTRB3组109.0±3.018.80±0.532.51±0.163.19±0.10 OGD/R组47.0±6.6(1)(2)(3)43.17±2.20(1)(2)(3)5.49±0.167(1)(2)(3)1.42±0.12(1)(2)(3)OGD/R+Scramble组49.0±5.6(1)(2)(3)47.13±1.50(1)(2)(3)5.57±0.15(1)(2)(3)1.44±0.09(1)(2)(3)OGD/R+shTRB3组82.7±6.1(1)(2)(3)(4)(5)25.63±1.05(1)(2)(3)(4)(5)3.44±0.23(1)(2)(3)(4)(5)2.25±0.19(1)(2)(3)(4)(5)F 76.28371.5190.8144.4 P<0.001<0.001<0.001<0.001

2.5 TRB3沉默对OGD/R诱导的大鼠脊髓星形胶质细胞中TNF-α、IL-1β水平的影响 与对照组比较，Scramble组和shTRB3组星形胶质细胞中TNF-α、IL-1β水平差异无统计学意义(P>0.05)，OGD/R组、OGD/R+Scramble组和OGD/R+shTRB3组星形胶质细胞中TNF-α、IL-1β水平明显增高，差异有统计学意义(P<0.05)；与OGD/R组和OGD/R+Scramble组比较，OGD/R+shTRB3组星形胶质细胞中TNF-α、IL-1β水平明显降低，差异有统计学意义(P<0.05，表2)。

表2 TRB3沉默对OGD/R诱导的大鼠脊髓星形胶质细胞中TNF-α和IL-1β水平的影响(ng/ml，±s，n=6)Tab.2 Effects of TRB3 silencing on the TNF-α and IL-1β levels in OGD/R-induced rat spinal astrocytes (ng/ml, ±s,n=6)

表2 TRB3沉默对OGD/R诱导的大鼠脊髓星形胶质细胞中TNF-α和IL-1β水平的影响(ng/ml，±s，n=6)Tab.2 Effects of TRB3 silencing on the TNF-α and IL-1β levels in OGD/R-induced rat spinal astrocytes (ng/ml, ±s,n=6)

TRB3. Tribbles同源蛋白3；OGD/R. 氧糖剥夺/再灌注；TNF-α. 肿瘤坏死因子-α；IL-1β. 白细胞介素-1β；与对照组比较，(1)P<0.05；与Scramble组比较，(2)P<0.05；与shTRB3组比较，(3)P<0.05；与OGD/R组比较，(4)P<0.05；与OGD/R+Scramble组比较，(5)P<0.05。

组别TNF-αIL-1β对照组0.24±0.010.13±0.01 Scramble组0.24±0.020.14±0.00 shTRB3组0.27±0.010.15±0.01 OGD/R组0.42±0.02(1)(2)(3)0.31±0.02(1)(2)(3)OGD/R+Scramble组 0.43±0.02(1)(2)(3)0.32±0.01(1)(2)(3)OGD/R+shTRB3组 0.31±0.03(1)(2)(3)(4)(5) 0.22±0.02(1)(2)(3)(4)(5)F 71.86115.10 P<0.001<0.001

2.6 NF-κB p65参与TRB3沉默对OGD/R诱导的大鼠脊髓星形胶质细胞凋亡的调节 为进一步研究TRB3调节OGD/R诱导的大鼠脊髓星形胶质细胞凋亡的作用机制，对NF-κB信号通路进行检测，结果显示，各组星形胶质细胞中细胞质总NF-κB p65蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。与对照组和Scramble组比较，shTRB3组星形胶质细胞中细胞核NF-κB p65蛋白表达水平明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与shTRB3组比较，OGD/R处理明显提高星形胶质细胞中细胞核NF-κB p65蛋白的表达水平，差异有统计学意义(P<0.05)；与OGD/R组和OGD/R+Scramble组比较，OGD/R+shTRB3组星形胶质细胞中细胞核NF-κB p65蛋白表达水平明显降低，差异有统计学意义(P<0.05，图4A)。进一步使用NF-κB激动剂BA处理OGD/R诱导的细胞，结果显示，与OGD/R组比较，BA处理能明显提高细胞凋亡率(36.15%±0.87%vs. 24.70%±1.05%，P<0.05)；与OGD/R+shTRB3组比较，BA处理能逆转TRB3 shRNA慢病毒感染对OGD/R诱导的细胞凋亡的抑制作用(13.91%±1.20%vs. 22.00%±1.04%，P<0.05，图4B)。

图4 NF-κB p65参与TRB3沉默对OGD/R诱导的大鼠脊髓星形胶质细胞凋亡的调节(n=3)Fig.4 NF-κB p65 participates in the regulation of TRB3 silencing on OGD/R induced rat spinal astrocytes apoptosis (n=3)

3 讨 论

SCI可造成严重的神经损伤，并可进一步导致认知功能丧失、肢体运动障碍甚至瘫痪，给患者带来巨大的痛苦[12]。氧化应激反应、炎症反应及神经细胞凋亡在SCI的发生和发展中发挥重要作用[13]。TRB3是Tribbles同源蛋白家族成员之一，而TRB3基因属于内质网应激诱导基因，多种应激条件如内质网应激、营养不足及氧化应激等均能调控其在细胞中的表达[14-15]。研究发现，TRB3可激活IL-6，使细胞抵抗棕榈酸盐诱导的细胞凋亡。而TRB3表达下调可阻止细胞因子诱导的Bcl-2相关X蛋白(BAX)的构型变化，抑制细胞凋亡。在全脑缺血再灌注大鼠中，TRB3表达下调可抑制全脑缺血再灌注损伤导致的神经元凋亡[9]。本研究建立OGD/R星形胶质细胞模型，模拟体内脊髓缺血再灌注损伤后星形胶质细胞的病理变化，发现TRB3在大鼠脊髓星形胶质细胞OGD/R模型中表达增加，提示TRB3可能在星形胶质细胞OGD/R损伤过程中发挥重要作用；采用TRB3 shRNA慢病毒感染细胞沉默TRB3的表达，进一步确定TRB3沉默可明显提高OGD/R诱导的星形胶质细胞的活性和细胞中SOD的活性，抑制LDH漏出，减少MDA的生成，从而减轻OGD/R对细胞的损伤。MDA和SOD是目前公认的SCI后能反映氧自由基水平的指标[16]，前者为脂质过氧化的最终产物，后者为细胞内主要的抗氧化酶。发生SCI后，减少MDA的生成、提高SOD的活性可减轻脂质过氧化反应及抑制自由基的释放，从而减轻脊髓受到的继发性损伤，为损伤脊髓的修复创造较好的环境[17]。

SCI可引起神经元凋亡增加，并可通过多种调节途径加重继发性SCI，导致不可逆的脊髓功能障碍[18]。本研究发现，OGD/R诱导大鼠脊髓星形胶质细胞损伤后，细胞凋亡增加，而TRB3沉默可明显抑制OGD/R诱导的星形胶质细胞凋亡。TRB3是C/EBP同源蛋白(CHOP)的靶标之一，也是CHOP的调控因子，可通过负反馈机制严格调控CHOP信号通路。正常生理条件下，TRB3是内质网应激诱导细胞凋亡的传感器。由短暂、温和的内质网应激诱导表达的TRB3，可通过结合CHOP和激活转录因子4(ATF4)阻断其功能。但长期内质网应激可诱导细胞产生过量的TRB3，最终导致细胞凋亡[15,19-20]。SCI后，持续的内质网应激可诱导TRB3高表达，而过量的TRB3最终导致神经元凋亡增加，提示TRB3可能是应激依赖性细胞死亡疾病的潜在治疗靶点。然而，目前尚无商品化的TRB3小分子抑制剂。

炎症是SCI后继发性SCI的关键机制[21]，主要是由损伤部位的星形胶质细胞分泌损伤相关分子引起的[22]。星形胶质细胞分泌的炎性因子如TNF-α和IL-1β等大量积聚并侵入SCI部位，可导致继发性炎症，从而加重SCI[23-24]。控制并减轻SCI后发生的炎症反应能够减轻SCI。本研究发现，OGD/R处理后，星形胶质细胞中TNF-α和IL-1β分泌增多，而TRB3沉默能够抑制OGD/R诱导的星形胶质细胞TNF-α和IL-1β的分泌，这可能有助于SCI后大鼠的功能恢复。

NF-κB是一种重要的转录因子，在SCI后发生的炎症反应、免疫应答、局部缺血再灌注及细胞凋亡等过程中起着重要作用[23,25]。NF-κB的细胞核易位及p65亚基的磷酸化对下游基因的激活至关重要。SCI后，NF-κB过度活化并迅速入核，调控靶基因引起严重的炎症反应，进一步加重SCI[26-27]。最近研究发现，NF-κB p65参与了TRB3的调节[15]。本研究发现，OGD/R处理后细胞核NF-κB p65表达水平升高，而TRB3沉默可抑制OGD/R诱导的细胞核NF-κB p65水平升高。进一步使用NF-κB激动剂BA处理细胞，发现BA能逆转TRB3沉默对OGD/R诱导的细胞凋亡的抑制作用，提示TRB3沉默可能通过抑制NF-κB通路活化而减轻脊髓星形胶质细胞损伤。

综上所述，本研究结果表明，TRB3沉默能够减轻OGD/R诱导的脊髓星形胶质细胞损伤，该结果为SCI后修复提供了理论依据。但本研究为体外细胞实验，后续研究需要进一步使用脊髓损伤动物模型探讨TRB3对脊髓损伤修复的影响及潜在应用价值。此外，未来应对TRB3小分子抑制剂进行研究，以期为应激依赖性细胞死亡疾病如SCI的辅助治疗提供新思路。