癫痫与焦亡的关系及相关机制研究现状*

杨 虹，何 莉，席萌丹，贺细菊，史丹丹，冯 娜，卢 敏△

湖北医药学院基础医学院 1组织胚胎学教研室 2人体解剖学教研室，十堰 442000

癫痫(epilepsy)是一类严重威胁人类健康的神经系统疾病，其病因复杂，表现形式多样，给家庭和社会带来极大负担。目前尚有较大比例的患者不能通过抗癫痫药物治疗得到有效缓解。癫痫发病机制尚不完全清楚，对癫痫发病机制的研究将有助于人类最终攻克这种疾病。已有研究表明：癫痫与焦亡(pyroptosis)关系密切，但其中机制不明。另外，在癫痫病灶中，炎性细胞因子增多、神经元大量丢失、钙离子通道异常同时存在。这三者共存是否提示癫痫与焦亡的某些内在联系，值得深入探讨。本文将基于癫痫的典型病理变化，结合焦亡的激活途径，梳理焦亡参与癫痫的过程及机制研究现状，以期为进一步研究癫痫的发病机制提供新的视角。

1 癫痫概述

癫痫是临床上最常见的神经系统疾病之一。全球约有7000万癫痫患者，其中90%以上在中、低收入国家[1]。通过合理的抗癫痫药物(antiepileptic drugs，AEDs)治疗，部分患者病情能够得到较好的控制，但仍有30%的患者治疗效果欠佳，对AEDs耐受或者反复发作，称为难治性癫痫(refractory epilepsy，RE)。癫痫不仅导致患者智能及身体机能受损，发生意外及受伤的风险增高，也是一种潜在的致死性疾病，给家庭和社会带来很大的经济负担，同时引发一系列的社会心理问题。我国有近千万癫痫患者，每年新发病例40万～60万。虽然抗癫痫药物在不断地更新换代，但目前癫痫的全球形势不容乐观[2-3]。

癫痫表现形式多样，是一种以反复性、发作性、短暂性，通常也是刻板性的脑功能失调为特征的慢性脑部疾病[4]。癫痫的病因复杂，尽管有许多危险因素可导致癫痫，如中风、神经退行性疾病、感染、脑部肿瘤、脑外伤、先天畸形等，但全球约50%癫痫病例尚未发现明确病因。癫痫发病机制尚未完全阐明，有学者认为，癫痫的发病与神经-免疫-内分泌网络调节失衡密切相关，以神经机制为主，免疫和内分泌分别在受体、信使和基因水平对其进行调节[5]。目前较一致的观点是，癫痫发病是中枢神经系统兴奋性系统与抑制性系统失衡所致。而这种不平衡主要与离子通道的异常改变有关。离子通道是体内可兴奋性组织兴奋性调节的基础，其编码基因突变可影响离子通道功能，从而导致某些疾病的发生。在癫痫病灶中，炎性细胞因子增多、钙离子通道异常和神经元大量丢失同时存在[6]。

2 癫痫与焦亡

2.1 癫痫与细胞死亡

细胞死亡对于胚胎发育和维持组织稳态是重要的生物学过程。在神经元中，细胞死亡的精细调节对神经元正常的自我更新活动至关重要。癫痫过程常伴随神经元的死亡。国际抗癫痫联盟认为，癫痫最突出的病理生理特征是患者脑部存在着能导致癫痫反复发作的易感性，而这种易感性存在的基础是神经元死亡，病灶内残存的神经元、新生神经元及增生的胶质细胞形成异常网络，导致癫痫发生，继而引起新的神经元死亡，出现新的异常网络，成为新癫痫发作的病因，形成恶性循环[7]。在癫痫过程中，神经元的死亡方式有多种，包括凋亡、坏死性凋亡、自噬、铁死亡、焦亡等。

凋亡(apoptosis)早在1972年被发现，以细胞皱缩、DNA断裂和染色质凝结为特征。在体情况下，死亡信号导致细胞色素C(cytochrome C，cyt-C)的释放，进而产生凋亡复合体。凋亡与癫痫二者间的密切相关性是被普遍认可的。凋亡信号的激活可加重癫痫脑损伤并导致持续的癫痫发作[8]，胞内钙聚集通过激活凋亡通路而介导神经元的死亡[9]。

坏死性凋亡(necroptosis)是细胞中最具特征性的调节性坏死，由受体相互作用蛋白3(receptor-interacting protein 3，RIP3)及其底物混合系列蛋白激酶样结构域(mixed lineage kinase domain-like，MLKL)介导，与癫痫关系密切。在癫痫中观察到坏死性凋亡的现象，如RIP1，RIP3和MLKL的升高以及细胞膜破裂[10]。而通过化学物质抑制坏死性凋亡则可保护神经元，对抗癫痫所致海马损伤[11]。

自噬(autophagy)是对过量或有缺陷的大分子和细胞器的溶酶体降解过程，发生在营养刺激后，通过对大分子的再利用，对能量供应和分子构建模块发挥重要作用。自噬对癫痫的作用尚不明确，但在戊四氮(pentetrazole，PTZ)、海人酸(kainic acid，KA)或匹罗卡品(pilocarpine)诱导的不同癫痫模型中均观察到自噬的典型表现，如自噬相关蛋白膜型与胞质型比值LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和自噬效应蛋白Beclin-1升高[12-13]。

铁死亡(ferroptosis)是铁离子依赖的程序性细胞死亡方式，以致命的脂质活性氧的积累为特征[14]。直接和间接的证据表明，在癫痫过程中有神经元铁死亡现象的出现[15]。而通过铁离子螯合剂减少其浓度则可抑制癫痫发作[16]。

焦亡(pyroptosis)是近年发现并证实的一种新型程序性细胞死亡方式，依赖天冬氨酸蛋白水解酶1(cysteine aspartate-specific protease，Caspase-1)，以炎性体(inflammasomes)的激活为特征[17]。研究表明，细胞焦亡参与多种疾病过程，在癫痫中也有发生[18]，在难治性癫痫患者脑内有炎性体的激活，而在杏仁核点燃动物模型中，抑制NOD样受体蛋白3(NOD-like receptor protein，NLRP3)型炎性体则可减轻癫痫发作所致的神经元损伤[19]。新近研究发现，阿曼托黄素可通过抑制NLRP3炎性体影响癫痫发生,同时对神经元起到保护作用[20]。

2.2 癫痫与焦亡

焦亡是一种炎症性的程序性细胞死亡，是机体对多种因素刺激产生的固有免疫反应。有害刺激因素通过依赖Caspase-1的方式诱导胞质内炎性体的形成，激活Caspase-1，进一步促进白介素-1β(interleukin 1β，IL-1β)、白介素-18(interleukin 18，IL-18)等细胞因子的成熟分泌，同时剪切促焦亡因子Gasdermin D(GSDMD)，使其N端解离并向细胞膜聚合形成功能性的孔道，胞膜完整性被破坏，细胞内容物包括IL-1β和IL-18等经由孔道流出，导致细胞焦亡[17]。细胞焦亡的典型特征是：细胞膜形成质膜孔，细胞逐渐膨胀至质膜破裂，细胞内容物释放，激活强烈的炎症反应，伴大量促炎症因子(包括IL-1β、IL-18等)释放。一般情况下，释放的炎性因子可以清除病毒、细菌，对细胞是一种保护机制。但焦亡的过度激活，也可对机体造成伤害[21]。

炎性体的激活是细胞焦亡发生的关键因素。经典炎性体(canonical inflammasome)经由Caspase-1途径激活[22]，是胞质内一类大分子蛋白复合物，主要由3部分构成，即胞内模式识别受体PRRs(patern-recognize-receptors)、促炎性半胱天冬氨酸酶Caspase(主要是Caspase-1)及凋亡相关点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein CARD domain，ASC)。三部分结构在炎性体激活之前分散存在于胞质中。PRRs包含多种类型，NLRP3是目前研究最多的一种，当NLRP3被活化，三部分结构相互结合，装配形成NLRP3-SAC-caspase-1复合体，在胞质内形成直径约0.8～1 μm的炎性小斑(inflammasome speck)[23]。炎性小斑的出现是炎性体形成的重要特征。接着Caspase-1前体活化、水解、聚合成为具有活性的Caspase-1[24]，活化的Caspase-1进一步剪切炎性因子IL-1β和IL-18的前体为其成熟体并释放。同时，活化的Caspase-1也剪切GSDMD，其N末端游离下来并聚集于细胞膜形成质膜孔，致使细胞内容物流出，引起细胞焦亡。从细胞中释出的炎性小斑又可作为一种伤害性刺激扩大炎性反应[25-26]。多种致炎刺激可以激活NLRP3炎症小体，如感染性刺激包括细菌、病毒、细菌毒素等，非感染性因素包括离子胞内外流动(如K+出胞)、核内体破裂、活性氧(reactive oxygen species，ROS)产生、线粒体损伤等。

NLRP3炎性体激活在多种神经系统疾病中被广泛研究。在一些神经系统疾病中，神经元内出现NLRP3炎性体激活和后续一系列反应如Caspase-1激活、IL-1β活化等现象[27]。研究发现，在癫痫患者和KA致痫大鼠海马组织中NLRP3水平升高，抑制NLRP3炎性体对大鼠杏仁核点燃所致癫痫持续状态的神经元是一种保护作用[28]。姜黄素抑制癫痫模型鼠NLRP3炎性体激活的同时减少神经元的损失[29]。NLRP3炎症体在颞叶内侧癫痫患者中表达上调[30]。

3 焦亡参与癫痫的机制

3.1 癫痫与炎症

越来越多的研究表明，炎症在癫痫发病过程中扮演重要角色[31-34]。炎症细胞因子在脑内发挥多重作用，包括神经递质代谢、神经内分泌功能、突触可塑性、多巴胺能的传递、神经发生以及情绪的神经回路等[35]。过去几十年积累的临床和实验数据表明，脑内的炎性病变在癫痫病理过程中也发挥重要作用，炎症和癫痫之间存在着互为因果的关系，形成恶性循环。约30%癫痫患者耐药，其病理机制之一就是神经炎症(neuroinflammation)，神经炎症扩大神经病变，过度的神经免疫反应最终使病情不断恶化[36-37]。

另有研究发现，炎性介质如环氧酶2(cyclooxygenase2，COX-2)和核转录因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)等的激活，以及下游炎性因子如白介素IL-1β、IL-6、肿瘤坏死因子TNF-α、前列腺素PGE2等的过度释放参与了癫痫发作的持续进展[38]。促炎介质如COX-2/PGE2、IL-1β、TGF-β、Toll样受体TLR4，以及TNF-α在癫痫灶内表达升高[39]。IL-1β在正常大鼠海马几乎检测不到，但在电刺激癫痫大鼠海马内表达显著增高，而阻断IL-1β通路则显著降低动物癫痫发作频率，采用IL-1β抑制剂治疗难治性癫痫患者能有效改善患者临床发作的情况，提高患者生活质量和社会功能[40]。

3.2 癫痫与钙离子通道及钙动员

作为细胞内重要的第二信使，钙离子(calcium ion，Ca2+)在细胞生理、病理过程中发挥广泛的作用，在癫痫发病过程中也扮演重要角色。早在2001年，Badea等[41]用Ca2+成像的方法观察了神经元参与癫痫发作的情况，证实Ca2+快速内流和细胞去极化有关。当这种去极化达到一定程度时就触发Na+内流，从而引发一系列迅速的去极化过程，导致神经元过度激活。Ca2+/钙调素依赖蛋白激酶Ⅱ(Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ，CaMKⅡ)可改变谷氨酸(glutamic acid，Glu)、γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)和胆碱能受体等的基因转录水平，而这些蛋白都是调控神经元兴奋性的重要分子[42]。

分布于细胞膜或胞内钙库(如内质网)膜上的Ca2+通道是调控胞内Ca2+信号的结构基础。Ca2+通道种类繁多，传统的通道包括受体依赖性Ca2+通道、第二信使激活的Ca2+通道、机械激活的Ca2+通道、漏电流Ca2+通道等。其中电压门控Ca2+通道与癫痫的关系研究较多[43-44]。近年来，一种新型的Ca2+通道——瞬时受体电位(transient receptor potential，TRP)通道被发现，其中经典型TRP(canonical or classical TRP，TRPC)对神经系统的作用被广泛研究。在哺乳动物中，TRPC包括7个亚型(TRPC1～7)，其中TRPC2在人细胞中不表达，其它类型在各组织中广泛表达。TRPC在癫痫中的作用备受关注。已有文献报道，TRPC1在局部皮质发育不良所致癫痫患者脑组织中过度表达[45]。TRPC3在颞叶癫痫患者脑内表达上调[46]，在KA致痫大鼠脑组织中TRPC3在mRNA及蛋白水平均较对照组明显升高[47]。在匹鲁卡品诱发的癫痫持续状态中，TRPC3对θ波的形成至关重要[48]。TRPC3介导了未成熟皮质和实验性皮质发育不良情况下神经元的过度兴奋和癫痫样活动[49]，还参与了癫痫持续状态下血管性水肿形成[50]，以及热性惊厥时神经元的死亡和神经炎症[51]。在特异性抑制TRPC3通道后，海人酸所致大鼠癫痫发作程度减轻[52]。TRPC4基因与癫痫大发作有明显相关性，在皮质功能失调合并结节硬化的病人皮质中表达升高[53]。TRPC5在局部皮质功能失调的皮质损伤中表达升高[54]。TRPC6在颞叶癫痫病人脑内表达上调但其作用与TRPC3相反[55]。在脑片研究中，TRPC7在细胞水平对CA3区锥体神经元自发性癫痫发生发挥关键作用，在突触水平对神经元长时程增强至关重要[56]。

钙动员(calcium mobilization)对激活NLRP3炎性体有积极作用[57]。线粒体在钙动员过程中扮演重要角色，在线粒体膜上已知存在3种与线粒体Ca2+摄入相关的通道蛋白，即线粒体钙单向转运体(mitochondral calcium uniporter，MCU)、线粒体钙氢交换体(mitochondrial Ca2+/H+antiporter，Letm1)、经典型瞬时受体电位通道3(canonical transient receptor potential 3，TRPC3)。经其介导，线粒体从内质网或胞外摄入Ca2+，从而调节钙的时空分布模式(spatiotemporal patterns)。生理情况下，线粒体摄入钙能够维持线粒体正常代谢，而过度或持续的钙内流则引起线粒体钙超载，产生高水平线粒体活性氧(mitochondrial reactive oxygen species，mROS)和线粒体通透性转换(mitochondrial permeability transition，MPT)，致使线粒体损伤和细胞死亡。在这个过程中，钙信号调节线粒体的运动、融合、分裂，进而调节NLRP3炎性体的激活[58]。

癫痫患者脑部存在钙信号紊乱，而钙稳态(calcium homeostasis)对于调控神经元兴奋性和痫性发作敏感性起关键性作用。通过激活不同的钙信号途径所导致的神经元过度同步放电是癫痫的典型特征[59]，而通过调节钙稳态则可改善癫痫发作[60]。在特异性阻断TRPC3通道后，海人酸所致癫痫大鼠海马内NLRP3水平降低[52]。

4 总结

基于以上文献分析，总结得出：①癫痫过程中伴随炎性反应，炎症因子大量释放；②癫痫的发生发展与Ca2+通道如TRPC的结构或功能异常密切相关；③癫痫灶内有大量神经元死亡，包括炎症性细胞死亡，即焦亡；④焦亡的激活有赖于细胞内钙动员过程，而线粒体膜上的钙通道如TRPC3在此过程中扮演重要角色。

由此推测，在癫痫过程中，钙通道如TRPC3在神经元线粒体膜上表达升高，启动钙动员，导致线粒体钙超载继而损伤，激活NLRP3/Caspase-1/GSDMD途径启动神经元焦亡，病区脑组织神经元大量丢失，同时炎性介质的释放又加重癫痫的发生发展，形成恶性循环(机制假说如图1)。这便解释了在癫痫灶内炎性细胞因子增多、神经元大量丢失、钙离子通道异常同时存在的原因。当然，这一假说还存在许多疑问，尚需进一步研究。

图1 焦亡参与癫痫的机制假说图Fig.1 Hypothesis diagram：the mechanism of pyroptosis involved in epilepsy