抵当汤早期干预对2 型糖尿病大鼠血管内皮细胞黏附连接的影响*

张英俊，常 柏，谭力子

1 天津中医药大学，天津301617；2 天津医科大学朱宪彝纪念医院

2型糖尿病（type-2 diabetes mellitus，T2DM）由胰岛素抵抗或胰岛素分泌相对缺乏引起，其并发症之一的大血管病变已成为糖尿病致死、致残的主要原因，目前发现强化降糖并不能有效延缓大血管病变的发生［1］。糖尿病属中医“消渴”“脾瘅”范畴，大血管病变是消渴日久，瘀血阻络所致的变证。抵当汤出自《伤寒杂病论》，有破血逐瘀功效。前期试验发现［2］，抵当汤可抑制血小板黏附以及血管内皮细胞（vascular endothelial cells，VEC）炎症反应，从而延缓血管病变进程。动物实验证明［3-4］，抵当汤早期干预可降低CD68、E-选择素、TNF-α表达，上调NO、血清IL-4、IL-3，调节腺苷酸活化蛋白激酶，对糖尿病大血管起保护作用。VEC 结构及连接方式正常是保证血管完整性、稳定性、通透性的关键因素之一，而黏附连接最为广泛。本研究观察抵当汤对血管内皮细胞间黏附连接中各因子的影响，探究抵当汤对糖尿病大血管病变的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物雄性健康SD 大鼠150 只，4 周龄，体质量（105.9±5.1）g，由天津动物实验中心提供，动物合格证号：SCXK2014-0001。予普通饲料适应性喂养，期间注意通风、温度、湿度、整洁、光线等环境因素，定期更换垫料，自由饮水，饲养1 周后进行实验。饲料包括普通饲料与高脂饲料，由天津实验动物中心提供。

1.2 药物抵当汤药物组成：水蛭3 g，虻虫1.5 g，桃仁5 g，熟大黄10 g，购买饮片后水煎，煎好减压浓缩到每毫升1 g，置于4℃冰箱保存备用；二甲双胍（施贵宝公司，批号：H20023770，规格：0.5 g/片）；辛伐他汀片（杭州默沙东制药有限公司，批号：H19990366，规格：20 mg/片）。

1.3 试剂与仪器链脲佐菌素（STZ，美国sigma公司）；Western blotting 试剂盒（武汉博士得生物工程有限公司）；PCR 试剂盒（北京康为世纪生物科技有限公司）；胰岛素放免测定试剂盒（天津九鼎医学生物工程有限公司）；显微镜（日本奥林巴斯）；离心机（Eppendorf）；多功能真彩色细胞图像分析管理系统（美国Media Cybernetics 公司）；荧光定量PCR仪（Applied Biosystems）。

1.4 方法

1.4.1 分组及造模 150 只大鼠适应性喂养1周。随机选20只大鼠为正常对照组。其余130只大鼠高脂饲料喂养8 周，内眦静脉取血测空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）及血清胰岛素水平（serum insulin level，Ins），计算胰岛素抵抗指数（ISI=Ln［1/（FBG）（Fins）］），将出现胰岛素抵抗的大鼠随机选取20只作为抵当汤早期干预组，抵当汤灌胃4周。除正常对照组（等量枸橼酸缓冲液）外其余大鼠尾静脉注射STZ 溶液（30 mg/kg）。注射1周后测随机血糖，血糖＞16.7 mmol/L为T2DM造模成功，共108 只。成模大鼠（除抵当汤早期干预组20只）按体质量、血糖分层，随机分为5组，分别为：糖尿病模型组（18 只）、抵当汤中期干预组（17 只）、抵当汤晚期干预组（18 只）、二甲双胍组（17只）、辛伐他汀组（18只）。

1.4.2 药物干预及取材 按照人鼠等效剂量抵当汤2.05 g/（kg·d）、二甲双胍160 mg/（kg·d）、辛伐他汀2.1 mg/（kg·d）进行灌胃，每日1 次，正常对照组和糖尿病模型组灌胃等剂量无菌饮用水，每日1 次。抵当汤早（成模前4 周）、中（成模时）、晚（成模后4 周）期组均等剂量给药，二甲双胍组、辛伐他汀组于成模时给药。每2周测空腹及餐后血糖。24周结束喂养，颈椎脱臼处死取胸主动脉组织，部分用于HE 染色，部分置于液氮中速冻，-80℃低温冰箱保存。

1.4.3 胸主动脉结构观察 准备载玻片，将大鼠胸主动脉血管放入甲醛固定剂中24 h，冲洗酒精脱水，放入二甲苯和无水酒精溶剂中（1∶1），切片，展片、粘片，HE染色，光镜下观察胸主动脉结构。

1.4.4 Western blot 检测血管内皮细胞钙黏蛋白（VE-Cad）表达 取出大鼠胸主动脉，生理盐水冲洗2遍，加入裂解液和PMSF，考马斯亮蓝法测细胞样本蛋白含量，制备SDS-PAGE 胶，-80℃冰箱取出提取的总蛋白样品插入冰中待融化，加入相应体积总蛋白样品与5×蛋白质凝胶电泳上样缓冲液，放入凝胶孔进行电泳，凝胶转模检测，用非标记一抗及辣根过氧化物酶标记的二抗对其进行孵育、检测，用image J软件分析灰度值。

1.4.5 Rap1、MAGI1、Tie2 表 达 检测 用SYBR GreenⅠReal-Time PCR 方法检测大鼠血管组织Rap1 相关蛋白1（Rap1）、膜相关鸟苷酸激酶1（MAGI1）、酪氨酸蛋白激酶2（Tie2）表达。使用超纯RNA 提取试剂盒（CWbio.Co.Ltd，Cat#CW0581）提取组织样本中总RNA，取5 μL RNA 用1% 琼脂糖凝胶进行电泳，用DNaseⅠ试剂盒（CWbio.Co.Ltd，Cat# CW2090）对RNA 中残留的基因组DNA 进行消化处理，用HiFi-MMLVcDNA 第一链合成试剂盒（CWbio.Co.Ltd，Cat#CW0744）进行反转录，仪器使用ABI 7500 型荧光定量PCR 仪，分析方法采用2-△△CT 法对数据进行相对定量分析。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.5 统计学方法采用SPSS 17.0 分析数据，计量资料以xˉ±s表示，两样本均数比较采用独立样本t检验，多样本均数比较采用方差齐性检验，组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），组间方差齐采用LSD 法，方差不齐采用Dunnet T3法，P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 胸主动脉内皮细胞变化光镜下正常对照组动脉内膜较光滑，中膜及弹力膜排列相对规则，平滑肌细胞无变性；糖尿病模型组动脉内膜不完整，内皮细胞（endothelial cells，EC）大部分缺失，脂质沉积，中膜排列较乱，平滑肌细胞有少量变性、坏死，与对照组比较损伤较重；抵当汤早期组与辛伐他汀组动脉内膜相对完整，EC 局部缺失，有少量脂质沉积，中膜排列较整齐，平滑肌细胞少见变性、坏死，与模型组相比损伤较轻；抵当汤中期组及二甲双胍组动脉内膜较光滑，局部EC缺失，中膜排列较紊乱，少量平滑肌细胞变性、坏死；抵当汤晚期组内膜不完整，EC 缺失，中模排列紊乱，平滑肌变性、坏死。见图1。

图1 光镜下大鼠胸主动脉病理改变（HE，×400）

2.2 VE-Cad 表达情况与正常对照组比较，糖尿病模型组胸主动脉VE-Cad 的表达下降,差异具有统计学意义（P＜0.05），抵当汤早期组、二甲双胍组、辛伐他汀组胸主动脉VE-Cad 的表达无明显差异（P＞0.05）；与糖尿病模型组比较，抵当汤早、中期组、辛伐他汀组胸主动脉VE-Cad 表达上升，差异有统计学意义（P＜0.05）；与抵当汤晚期组比较，抵当汤早期组和辛伐他汀组胸主动脉VE-Cad的表达上升，差异有统计学意义（P＜0.05），二甲双胍组无明显差异（P＞0.05）；抵当汤早期组和二甲双胍组、辛伐他汀组之间比较，无明显差异（P＞0.05）。见图2—3。

图2 各组大鼠VE-Cad的表达（xˉ± s）

图3 各组VE-Cad电泳条带图

2.3 Rap1、MAGI1 及Tie2 基因表达情况与正常对照组比较，抵当汤早期组、辛伐他汀组胸主动（P＞0.05），糖尿病模型组Rap1、MAGI1、Tie2 mRNA的表达下降,差异具有统计学意义（P＜0.05）；与糖尿病模型组比较，抵当汤早、中期组、二甲双胍组、辛伐他汀组Rap1、MAGI1、Tie2 mRNA 的表达上升，差异有统计学意义（P＜0.05）；与抵当汤晚期组比较，抵当汤早、中期组、二甲双胍组和辛伐他汀组Rap1、MAGI1、Tie2 mRNA 的表达明显上升，差异有统计学意义（P＜0.05）；抵当汤早期组和辛伐他汀组比较无明显差异（P＞0.05）。见表2。

表2 各组大鼠血管内皮Rap1、MAGI1、Tie2基因的表达（xˉ± s）

3 讨论

血管内皮属机体最大的内分泌器官之一［5］，其EC 结构、连接方式正常，才能实现血管内皮功能，内皮功能的损害已被认为是糖尿病血管病变的早期病变信号［6-7］。在VEC 连接中，紧密连接和缝隙连接穿插于黏附连接中，且黏附连接分布更广泛［8］，黏附连接与血管内皮的通透性有关，通透性的改变会加剧动脉粥样硬化，推动大血管病变的发生发展。

VE-Cad 属钙黏蛋白家族成员，能特异性表达在VEC 上，黏附连接以VE-Cad 为中心，VE-Cad 通过β-catenin、γ-catenin 与肌动蛋白细胞骨架相关的α-catenin 相连，形成钙黏蛋白-联蛋白复合体。VE-Cad 在Ca2+存在下形成二聚体，进一步与相邻的细胞顺二聚体反式结合，形成EC 黏附连接结构，维持血管内皮稳定。VE-Cad 主要位于细胞连接的中上层，最先、也最容易受到外界刺激而产生一系列变化。其中，VE-Cad 在通透性调节方面可能是由于钙黏蛋白-联蛋白复合体酪氨酸磷酸化及去磷酸化导致了通透性增加。研究显示［9］，VE-Cad 是维护血管内皮结构和功能完整性所必须的物质，且可作为监测糖尿病大血管病变的指标。

Rap1 属小分子G 蛋白Ras 超家族成员，Rap1影响细胞间黏附连接的定位及其完整性［10］。在EC 连接形成初期部位，VE-Cad 在细胞间连接部位激发Rap1 活性化，使得Rap1 活性上升。Rap1 亦可促进VE-Cad 表达，稳定VE-Cad 形成的黏附连接［11］。MAGDALENA 等［12］在STZ 诱导的糖尿病模型中发现，Rap1 可增强细胞黏附、稳定血管，还可防止高通透性。

MAGI1 属MAGUK 支架蛋白家族，通过定位于细胞间接触而起支架分子作用。 ATSUKO［13］认为MAGI1 在连接β-catenin 后利于Rap1 激活；消耗MAGI1 会削弱黏附连接；在细胞连接处MAGI1 与VE-Cad 和β-catenin 形成复合物且其介导的信号可增强VE-Cad介导的黏附连接。

Tie2 特异性表达在EC 上，和血管生成素1（Ang-1）组成的受体系统具有抵抗凋亡、抑制炎症反应、维持血管稳定、减轻血管渗漏等作用，有研究证明Ang-1/Tie2 信号经Rap1 介导增强VE-Cad连接，使血管结构稳定。Tie2 单抗本身也可激活Ang-1/Tie2信号系统，而单独抑制Tie2的表达会增加血管内皮通透性。有学者研究发现，Ang-1/Tie2会对血管内皮细胞钙依赖黏连蛋白复合物产生影响。

抵当汤是破血逐瘀要方，其中水蛭、虻虫均炒制，大黄久煎。现代研究认为水蛭［14］、虻虫可快速结合凝血酶，抑制纤维蛋白原转化为纤维蛋白，降低凝血，或直接结合凝血酶溶解血栓。大黄能影响黏附蛋白表达，改善VEC 活性物质分泌，减轻血管炎性病变，降低血液黏稠度，起到抗血栓、抗动脉粥样硬化等作用。桃仁［15］能使大鼠TRIB3 基因、TLR4 蛋白及MAPK mRNA 表达降低，抑制大血管纤维化，从而对本病的纤维化起改善作用。

糖尿病大血管病变属中医“脉痹”范畴［16-17］，《素问·脉要精微论篇》中“五脏脉搏坚”可与动脉硬化相关联，属消渴兼证，其总病机为阴虚燥热，渐至气阴两虚，随着病程的延长最终导致阴损及阳，阴阳两虚。仝小林［18-20］认为消渴患者大多经历“郁、热、虚、损”4个阶段，且瘀血贯穿始终。

本研究结果显示，糖尿病模型组大鼠VE-Cad、Rap1、MAGI1、Tie2表达低于正常对照组，与上述结果一致，辛伐他汀组、抵当汤早、中期组各指标水平高于糖尿病模型组，且早期组优于晚期组，光镜下大鼠胸主动脉结果显示糖尿病早期给予抵当汤干预可改善糖尿病大血管病变细胞间连接，增强VEC 黏附连接，增强血管稳定性，改善血管通透性，减轻血管内皮损伤，延缓糖尿病大血管病变的发生、发展。然而，血管内皮细胞间连接机制复杂，其中抵当汤的治疗中是否有更多重要因子参与仍需进一步研究。