生肌玉红膏对大鼠糖尿病足溃疡组织bFGF、HIF-1α 及VEGF 表达的影响*

陈盛业，甘 宇

沈阳市第七人民医院，辽宁 沈阳110032

糖尿病足（diabetic foot，DF）又称为糖尿病性肢端坏疽，是由糖尿病外周血管病变和（或）神经病变感染等因素造成足或下肢组织破坏的一种病变［1］。有研究指出［2］，发生足溃疡或坏疽的糖尿病患者达15%以上，糖尿病足部溃疡是85%的糖尿病患者截肢的主要原因，严重影响患者生活质量。血管基底膜增厚、内皮损伤、血液高黏滞综合征表现、微循环障碍等是形成糖尿病足的主要病理基础［3］，而血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）作为促血管生成的主要因子，能够促进血管生成及修复，改善微循环，从而加快糖尿病足溃疡的愈合。低氧诱导因子1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）在缺氧条件下能调控VEGF 转录来控制VEGF 表达程度。生肌玉红膏能促进糖尿病足溃疡创面愈合，达到解毒生肌效果。本研究通过建立糖尿病足大鼠模型探讨生肌玉红膏对糖尿病足创面局部组织中VEGF、HIF-1α 及bFGF 表达的影响，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 实验动物清洁级成年SD大鼠60只，雄性，体质量200～250 g，由辽宁中医药大学实验动物中心提供，实验动物合格证号：LNZY辽2017030。

1.2 主要试剂与仪器生肌玉红膏源自《外科正宗》，药物组成：当归、白芷、紫草、血竭、甘草、轻粉、麻油（所有药物由辽宁中医药大学附属医院制剂室制备，采用适量基质调制成膏剂，外敷创面使用）。凡士林纱布由辽宁中医药大学附属医院提供。 链脲佐菌素STZ（美国Sigma 公司，批号：B01106002，规格：1 g）；无菌枸橼酸缓冲液（北京化工厂，批号：20080429）；酶联免疫检测仪、MK3（芬兰雷勃公司）；bFGF（北京中杉金桥生物技术有限公司，批号：sc-79，规格：48T）、HIF-1α（北京中杉金桥生物技术有限公司，批号：BKE9281，规格48T）、VEGF 酶联免疫组化染色试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司，批号：CYT-241，规格96T）。

1.3 动物造模与分组60只雄性SD大鼠用高脂饲料喂养，2 周后禁食（不禁水）16 h，一次性腹腔注射STZ 50 mg/kg（用pH 4.4 的无菌枸橼酸缓冲液配成0.25% 浓度）；72 h 后断尾取血，测定血糖，血糖＞12 mmol/L者为糖尿病大鼠，将糖尿病大鼠随机分为对照组、实验组各25 只。两组动物空腹8 h 后均以10% 水合氯醛1 mL/100 g（体质量）腹腔注射麻醉，足背部剃毛，常规消毒，用打孔器于大鼠双足足背部相同部位打孔，形成机械性全层皮肤圆形创面，直径为2 mm，溃疡深及筋膜层，止血后以无菌纱布包扎，分笼饲养，自由饮水，普通饲料喂养。

1.4 实验方法造模后实验组大鼠足局部创面予与创面等面积的生肌玉红膏油纱布覆盖，对照组创面覆盖凡士林纱布，隔日更换敷料，连续用药14天。分别于造模后3、7、14天处死大鼠，距创缘0.1 cm 取材，固定于福尔马林中，常规脱水，石蜡包埋，沿创面最大截面切片，免疫组化法检测大鼠足局部创面组织中bFGF、HIF-1α及VEGF表达。

1.5 bFGF、HIF-1α 及VEGF 含量测定石蜡切片常规脱蜡，微波抗原修复，加3% H2O2去离子水3 mL，孵育5～10 min 阻断内源性过氧化物酶，PBS 冲洗，3 min×3 次，滴加封闭，用正常山羊血清工作液3 mL，室温孵育10～15 min，倾去，滴加适当比例稀释的一抗（bFGF、HIF-1α、VEGF），4℃过夜，室温30～60 min，PBS 冲洗3 min×3 次，滴加生物素标记山羊抗大鼠Ig G，37℃孵育10～15 min，PBS冲洗3 min×3 次，滴加辣根标记链霉卵蛋白工作液3 mL，37℃孵育10～15 min，应用DAB溶液显色，蒸馏水冲洗，苏木素复染，脱水，封片。高倍镜下（200 倍）由两名观察者采用双盲法对各组标本每个切片随机选取5 个视野，计数阳性细胞数及总细胞数，计算阳性细胞率。

1.6 阳性判定标准bFGF 免疫组化标记定位于细胞浆，细胞浆着色呈棕黄色为阳性细胞。HIF-1α蛋白表达以细胞核或胞质内有棕黄色颗粒为阳性，VEGF 阳性表达以细胞质或细胞膜中有棕色或深黄色颗粒状为阳性，细胞无着色为阴性。阳性细胞数＜10%为阴性（-），＞10%为阳性（+）。

1.7 统计学方法采用SPSS 21.0 统计软件分析数据，计量资料以xˉ±s表示，样本均数间比较用单因素方差分析，计数资料采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 bFGF 表达情况干预后bFGF 表达两组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；第7天bFGF表达两组均升高，实验组bFGF表达高于对照组（P＜0.05）；第14天bFGF表达进一步下降，两组间比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 两组大鼠不同干预时间点bFGF表达阳性计数（±s）

表1 两组大鼠不同干预时间点bFGF表达阳性计数（±s）

注：与对照组比较，*表示P＜0.05

组别对照组实验组鼠数25 25 3 d 16.7±4.8 22.6±5.2*7 d 22.5±3.5 30.6±6.1*14 d 10.0±3.8 6.4±3.7*

2.2 HIF-1α 表达情况干预第3 天HIF-1α表达两组比较差异有统计学意义（P＜0.01）；第7 天HIF-1α表达两组均升高，实验组高于对照组（P＜0.05）；第14 天HIF-1α表达下降，两组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 两组大鼠不同干预时间点HIF-1α表达阳性计数（-x±s）

2.3 VEGF 表达情况第3 天，实验组VEGF 水平升高较对照组明显，差异有统计学意义（P＜0.05）；第7天，VEGF表达量继续升高，实验组高于对照组（P＜0.05），两组间差异显著；第14 天，两组VEGF的表达量下降，实验组低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 两组大鼠不同时间点VEGF表达阳性计数（-x±s）

3 讨论

糖尿病足为慢性进行性疾病，西医虽能根治，但耗费巨大。糖尿病足属中医“消渴脱疽”范畴，多因瘀热邪毒凝滞经络导致气血运行不畅，肌肤失养所致，临床常用生肌玉红膏祛腐生肌，润肤止痛。方中当归、血竭活血养血，祛腐生肌，敛疮止痛；轻粉、紫草、甘草清热解毒，凉血祛腐；白芷辛温通窍，溃脓止痛；麻油滋润肌肤，调和诸药。药膏外敷渗透力强，能刺激毛细血管生成及扩张，增加创面营养和血供使得肉芽组织中血管扩张，促进血液循环及组织供氧，加速创面修复愈合［4］。

糖尿病足的慢性创伤，特点是慢性缺氧，炎症和生长因子分泌不足［5］。HIF-1 是细胞为了适应缺氧环境而产生的具有转录活性的转录因子，HIF-1α是HIF-1的调节亚基，氧气通过调节HIF-1α来调节HIF-1 的活性，因此HIF-1α的表达可以间接反映组织缺氧情况，内皮细胞增殖或损伤导致血管周围相对氧缺乏时，HIF-1α阳性表达升高。HIF-1α又可促使VEGF 转录激活，上调VEGF 表达并且增加VEGF mRNA 稳定性，从而促使血管生成。本研究结果显示，两组HIF-1α先高表达，后逐渐下降，两组比较差异明显。虽然敷料能够使创伤部位血管周围缺氧程度加重引起HIF-1α表达增加，但本实验结果提示生肌玉红膏能使大鼠糖尿病足溃疡组织HIF-1α表达升高，组织缺氧加重，表明实验组产生大量HIF-1α来促使VEGF 表达，加快血管生成修复。HIF-1α表达逐渐下降说明组织缺氧程度改善，而且创面修复愈合速度较前逐渐减慢，以产生瘢痕。

血管生成由生长因子和受损组织中受损细胞分泌的细胞因子协同作用［5］。VEGF作为促进血管生成的主要刺激因子，是伤口愈合的主要生长因子之一。有研究指出［6］，VEGF 表达活跃期主要集中在创面发生后的4～8 天；而DF 伤口愈合表现为VEGF 表达延迟，血管生成延缓，表皮细胞再生障碍。提高VEGF 水平能特异性引起血管内皮细胞分裂增殖、血管通透性增加，促进内皮细胞、单核细胞迁移及诱导血管生成［7］。通过血管壁重塑和融合逐渐形成具有功能的侧支动脉循环，重建缺血组织血流供应。VEGF 在维持和恢复内皮细胞完整性中发挥关键作用，可防止毛细血管丢失，保护内皮细胞不致发生程序性死亡，还可通过一氧化氮产生舒张血管平滑肌细胞，促使血流恢复，增加侧枝循环血量，进而起到保护作用［8］。本研究实验组VEGF 表达于第3、7 天升高，第14 天下降，但均高于对照组。其原因可能是生肌玉红膏促进HIF-1α的表达进而增加VEGF 表达，亦或直接提高VEGF 水平以增加血管通透性，促进细胞迁移及再生，诱导新血管生成。后期生成的血管逐渐改善了溃疡组织血供及营养，缓解了组织缺血、缺氧情况，因此HIF-1α表达下降进而使VEGF 表达下降。

bFGF 是一种多功能细胞生长因子，能够趋化炎症细胞、成纤维细胞等修复细胞向创面聚集，导致修复细胞大量增殖，bFGF 表达增加可上调组织修复细胞上生长因子受体活性，激活细胞增殖和肉芽组织生长，改善局部抗感染能力和营养状况［7］。姚昶等［9］研究证明在创面修复的炎症和增殖期，生肌玉红膏可增加bFGF 水平，促进创面胶原合成和上皮生长；塑形期bFGF 水平降低能促进过度增生胶原降解，使其排列有序，减少瘢痕形成。生肌玉红膏外用可促进创面微循环，减少微血栓，因此增加创面营养和血供，促进创面愈合。进一步证实了［10］生肌玉红膏促进创面修复，可能是通过调节创面肉芽组织中成纤维细胞生长因子bFGF 介导。总之，生肌玉红膏可改善创面微循环，促进创面愈合，其机制之一可能为调节创面肉芽组织内bFGF 含量。另外，王晓媛等［11］证明外用中药可上调局部组织bFGF 表达，促进疮疡局部血管生成和肉芽组织生长，改善局部营养状况，促进创面修复，达到治疗DF 的目的。本实验中敷有生肌玉红膏的bFGF 表达量高于敷有凡士林纱布的对照组，随着时间的延长，bFGF 表达量降低，但仍高于对照组。bFGF 表达水平的升高，提示着生肌玉红膏促进细胞增殖和肉芽组织生长，促进创面愈合。随着创面的逐渐修复，bFGF表达逐渐下降，既能继续修复创面细胞，增加创面营养和血供，又可防止瘢痕形成。

本实验采用高脂饲料结合STZ 建立的糖尿病模型与人类2 型糖尿病的发病机制相近，长期高脂饮食诱发的高血糖状态出现的2 型糖尿病符合临床实际［12］。应用打孔法制备糖尿病足大鼠模型，缩短了模型建立周期，确保创口部位、大小的相似性，以增加模型稳定性。不足之处是打孔法造成的足溃疡与临床糖尿病足自然发展为溃疡的过程不同，另外生肌玉红膏中轻粉虽然有提毒祛腐的作用，却在曝光或与水共煮条件下易分解而生成氯化汞及金属汞，长期应用易导致蓄积中毒，用药后局部红肿、瘙痒等不良反应多由此引起［13］。因此，是否需要去轻粉还有待进一步研究。

综上所述，生肌玉红膏在治疗糖尿病足过程中能促进bFGF、HIF-1α及VEGF 表达，初期及中期能促进细胞增殖，加快肉芽组织生长，促进局部血管生成，以恢复血供。后期，3 个因子表达均有下降但仍然高于对照组，显示其可继续促进创面的修复及愈合，改善组织缺氧状态及营养状况，还能防止瘢痕形成。