温肺疏风方治疗咳嗽变异性哮喘作用机制的网络药理学研究*

范荣荣 张 瞳 张忠德

（广州中医药大学第二附属医院，广东省中医院，广东 广州 510120）

咳嗽变异性哮喘（CVA）多因风邪致病，而“六气皆令人咳，风寒为主”，其夹杂致病中，又多以风寒之邪居多。CVA起病之初，邪在卫表，但由于失治误治，患者服用中药或抗生素等寒凉药物，或过早使用镇咳药，或过食寒凉食物，壅遏肺气，邪反入里，郁结于肺内，肺气不得宣泄，病情迁延，久病伤肺，肺气虚弱，卫阳不足。因此，风寒外袭，肺失宣肃，是CVA发病的外因，肺卫阳不足，易感外邪是CVA发病的内因。“肺病不远温”，治疗应该以温肺散寒、宣肺疏风止咳为法，肺卫阳不足得以改善，则能从根本上解决反复易感邪发病的问题。广东省名中医张忠德教授善用温肺散寒、宣肺疏风止咳的方法治疗CVA，其创立的温肺疏风方由蜜麻黄、细辛、五味子、紫苏叶等组成。临床研究发现温肺疏风方可能与沙美特罗/替卡松粉协同发挥减轻气道炎症反应的作用［1］。本研究借鉴网络药理学研究的方法，对尚缺乏基础实验研究的温肺疏风方进行靶点的挖掘和分析，进而预测其治疗CVA可能的作用通路，为后续开展该处方治疗CVA的机制研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 温肺疏风方化学成分及靶点挖掘 基于中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）数据库查找温肺疏风方中各味中药的化学成分，通过ADME参数（OB≥30%，DL＞0.18）进行筛选。对于不满足筛选条件，但在中药中含量高或相关药物活性的化合物通过查阅文献进行手动筛选添加。然后基于TCMSP数据库，将温肺疏风方中的有效成分逐一配对潜在靶点，再通过蛋白质数据库（http：//www.uniprot.org/）筛选出物种为“人”的靶点，即为温肺疏风方候选化合物的预测作用靶点。

1.2 哮喘相关靶点获取 以“asthma”作为检索词先分别从Drugbank、OMIM、KEGG及DisGeNET 4个数据库中检索哮喘相关靶点，再合并4个数据所得靶点，重复的靶点保留1个，所得靶点即为哮喘相关靶点。

1.3 网络构建及分析 将候选化合物的预测靶点与哮喘相关靶点进行映射，即两者取交集，所得的靶点即为温肺疏风方作用于哮喘的预测靶点。采用String数据库构建温肺疏风方作用于哮喘的蛋白质相互作用体内反应网络图，再选取评分＞0.9分的相互作用关系利用Cytoscape软件构建蛋白相互作用（PPI）网络，并进行拓扑分析。其中自由度和中心介数均大于平均值的靶点，可认为温肺疏风方作用于哮喘的关键靶点。

1.4 靶点通路富集分析 利用DAVID 6.8（https：//david.ncifcrf.gov/）对温肺疏风方作用于哮喘的预测靶点进行KEGG信号通路分析，以P＜0.05为截点，获得显著富集的信号通路，分析与哮喘相关的信号通路。

2 结果

2.1 候选化合物及其靶点的筛选 以OB≥30%，DL≥0.18作为筛选条件，结合手动筛选，共得到温肺疏风方中化合物防风18个、细辛8个、橘红9个、枇杷叶18个、浙贝母7个、前胡24个、紫菀19个、紫苏子14个、五味子8个、麻黄25个，删除重复部分后共得到97个候选化合物。基于TCMSP数据库查询化合物的靶点，重复靶点仅保留1个，共得到239个化合物靶点。

2.2 疾病靶点获取结果 从OMIM、Drugbank、KEGG数据库分别获取到48、93、10个哮喘相关靶点，从Disgenet数据库中获取到1 369个哮喘相关靶点，将4个数据库中获取的所有靶点合并，重复靶点仅保留1个，共得到哮喘相关靶点1 413个。

2.3 化合物靶点和哮喘靶点映射 将239个化合物靶点与1 413个哮喘相关的靶点进行映射，得到110个温肺疏风方作用于哮喘的靶点。

2.4 PPI网络构建 采用String数据库构建温肺疏风方作用于哮喘的体内反应网络图，如图1所示，线条越粗代表相互作用关系越强。选取评分＞0.9分的相互作用关系利用Cytoscape软件构建PPI网络如图2所示，该网络中节点的平均自由度为6.8，平均介数为0.028，其中自由度及中心介数均大于平均值的靶点共17个，可视为温肺疏风方作用于哮喘的关键靶点，其信息详见表1。

表1 关键靶点基本信息

图1 温肺疏风方作用于哮喘的体内网络反应图

图2 蛋白相互作用网络图

2.5 DAVID通路富集分析 将110个映射所得靶点导入DAVID数据库进行KEGG信号通路富集分析，共得到24条通路，以P＜0.05作为截点，显著富集的通路有20条，其中与哮喘相关的通路有11条，以气泡图直观表示与哮喘相关的通路（图3）。

图3 温肺疏风方作用于哮喘的KEGG信号通路富集气泡图

3 讨论

通过网络药理学的方法，预测得出温肺疏风方作用于哮喘的关键靶点有17个，包括JUN、STAT3、QBHIJ4、TNF、EDN1、MAPK等。温肺疏风方作用哮喘的可能通路有11条，由气泡图可以看出，11条通路中富集程度较高的通路包括TNF信号通路、Toll样受体信号通路、MAPK信号通路、cAMP信号通路、NOD样受体信号通路等。通过对温肺疏风方作用于哮喘的关键靶点和通路富集结果进行综合分析，我们发现温肺疏风方关键靶点中 JUN、MAPK1、TNF、MAPK8、RELA、MAPK14、CLCX8均在Toll样受体信号通路中，且集中在 TLR4-NFκB/MAPK 通路上（图 4），提示 TLR4-NFκB/MAPK通路是温肺疏风方对哮喘发挥抗炎作用的关键通路。

图4 Toll样受体信号通路

温肺疏风方由蜜麻黄、细辛、五味子、紫苏叶等组成。研究发现，麻黄能降低白细胞介素-5（IL-5）、白细胞介素-13（IL-13）和白细胞介素-8（IL-8）的分泌，减轻嗜酸性粒细胞在支气管肺泡灌洗液中的浸润，抑制气道重塑［2-5］。五味子和细辛是常用的中药药对。动物实验表明，这两种中药的有效成分可延长咳嗽潜伏期，降低咳嗽频率［6］。五味子提取物还可以提高抗氧化水平、减少氧化损伤、抑制气道平滑肌细胞增殖，这可能是其治疗哮喘的作用机制之一［7］。据研究报道，枇杷叶有抗炎和免疫调节作用［8-9］。枇杷叶注射液可以减少CD4+细胞的数量，增强CD8+细胞的功能，调节CD4+/CD8的失衡［10］。研究发现前胡可通过调节Th17/Treg细胞的失衡，减轻气道炎症，降低气道高反应性［11］。动物实验证明，橘红可以祛痰止咳，同时有抗炎、抗氧化和免疫调节作用［12］。另外，温肺疏风方中的枇杷叶、防风、紫菀也具有抗炎的作用［13-17］。综上所述，温肺疏风方全方可能具有抗炎、抗氧化、减轻气道高反应、调节免疫及抑制气道重塑的作用，其中抗炎是其主要作用。结合网络药理学分析结果，后期我们将对温肺疏风方通过TLR4-NFκB/MAPK通路治疗哮喘的作用机制进行验证。