水牛白细胞介素2的原核表达与活性鉴定

李小凤，谢芝勋，范 晴，谢志勤，谢丽基，黄娇玲，张艳芳，曾婷婷，王 盛，罗思思，李 孟，邓显文

(广西兽医生物技术重点实验室，广西兽医研究所，广西南宁 530001)

白细胞介素2(lnterleukin-2，IL-2)是Ⅰ型细胞因子家族的一员，最初被称为T淋巴细胞生长因子，具有广泛的生物学活性，在机体免疫过程中发挥重要作用[1-3]。IL-2能促进CD4+和CD8+T淋巴细胞增殖，增强自然杀伤细胞(NK细胞)和单核细胞等的杀伤活性[4-5]。以IL-2作为免疫佐剂，与人乳头病毒(HPV)疫苗共同使用可提高疫苗的免疫效果[6]。在体内，IL-2因子增强牛对乳房炎[7]、结核病[8]和疱疹病毒感染[9]的抵抗力，提高了机体的抗病毒功能。过表达IL-2蛋白，可以降低鸡新城疫病毒载量[10]和提高对人乳腺癌细胞的杀伤力[11]。可见，IL-2在疾病的防治中发挥着重要作用。

基于IL-2的重要功能，人和多种哺乳动物的IL-2相继在体外成功表达[12-14]，并作为商品化药物广泛应用于疾病治疗。水牛在广西有重要的经济地位，近年来规模化养殖增加，一些县市对养牛业非常重视，由病毒感染引起的牛病毒性传染病综合防控存在短板，新药的研发有待突破。因此，对水牛IL-2的研究具有很高实用价值。本研究旨在体外表达水牛IL-2，以期为研发重组水牛IL-2治疗性生物制剂奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 组织、病毒及细胞 水牛新鲜脾脏采自广西南宁某屠宰场；牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛肾细胞(MDBK细胞)由广西兽医生物技术重点实验室保存。

1.1.2 主要试剂 核酸提取试剂TRIzol试剂盒、IL-2山羊源多克隆抗体，美国Invitrogen公司产品；pMD-18T载体、T4 DNA连接酶、Hind Ⅲ与BamH Ⅰ限制性内切酶，宝生物工程(大连)有限公司产品；牛脾脏淋巴细胞分离液试剂盒、pET-32a(+)载体、刀豆蛋白A (concanavalin A，ConA)、10孔蛋白电泳预制胶、DAB显色液，北京索莱宝科技公司产品；大肠埃希氏菌DH5α与BL21感受态细胞，北京全式金生物技术公司产品；His标记小鼠源单克隆抗体、HRP标记山羊抗鼠IgG(H+L)、HRP标记驴抗山羊IgG(H+L)，武汉三鹰技术公司产品；His标签蛋白纯化试剂盒(可溶性蛋白)，北京康为世纪公司产品。

1.1.3 主要仪器 微量核酸测定仪(NanoDrop 2000)，赛默飞世尔公司产品；凝胶成像分析仪(Gel DocTM XR+)，美国Bio-Rad公司产品；洁净工作台(DL-CJ-1ND-Ⅱ)，北京东联哈尔仪器公司产品；振荡培养箱(MQT-60R)，上海旻泉仪器公司产品；倒置荧光显微镜(ECLIPSETi2-U)，日本Nikon公司产品。

1.2 方法

1.2.1 引物合成 参考GenBank上已公布的水牛IL-2编码区序列(登录号 AF363786.1)，使用Oligo 7.37进行引物设计，上、下游引物分别添加BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位点和保护碱基，上游引物为：ATAGGATCCTCAACTCCTGCCACAATGTAC(下划线为BamH Ⅰ酶切位点)，下游引物为：ATAAAGCTTAGTCATTGTTGAGTAGATGCTT(下划线为Hind Ⅲ酶切位点)，扩增产物长度500 bp。引物由广州睿博公司进行合成，用于IL-2基因编码区扩增。

1.2.2 水牛脾淋巴细胞培养 参照牛脾淋巴细胞分离试剂盒说明书进行水牛脾淋巴细胞提取，得到的淋巴细胞悬液用DMEM培养基将细胞密度调整为2×106个/mL，接种于6孔细胞培养板中培养6 h，20 mL DMEM培养基添加10 μg/μL的 ConA 40 μL，置CO2培养箱中37℃孵育18 h，收集淋巴细胞。

1.2.3 RNA的抽提与IL-2编码区基因的扩增 参照Trizol试剂盒说明书提取上述细胞总RNA，并用NanoDrop2000测定核酸浓度，参照Takara反转录试剂盒说明书合成cDNA。

以cDNA为模板，PCR扩增IL-2编码区基因片段，总反应体系为50 μL：2×TransTaq-T PCR Super Mix 25 μL，上、下游引物各1 μL(引物浓度10 μmol/L)，cDNA模板4 μL，无核酸酶水补足至50 μL。反应程序：95℃预变性3 min；95℃变性30 s，56℃退火1 min，72℃延伸1 min，34个循环；72℃延伸5 min。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离后，与pMD18-T载体连接，构建克隆载体，转化DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，双酶切鉴定，将正确阳性重组质粒送华大公司测序，用NCBI的Blast程序比对，DNAMan 软件预测IL-2基因所编码的氨基酸序列，T-IL-2质粒于-20℃保存。

1.2.4 表达载体的构建 pET-32a载体与T-IL-2质粒同时用Hind Ⅲ与BamH Ⅰ限制性内切酶于37℃双酶切6 h，切胶回收酶切产物，将二者于16℃连接过夜，转入BL21感受态细胞，经过PCR及测序验证，筛选插入完全正确的阳性菌。

1.2.5 目的蛋白诱导表达与可溶性分析 挑取阳性菌于37℃摇床过夜培养作为种子液，次日按1%接种量接种，培养4 h后加入IPTG至终浓度为1.0 mmol/L，37℃继续诱导培养6 h。收集诱导后的50 mL菌液，4 000 r/min离心5 min，弃上清，PBS洗涤2次，加入细菌裂解液与PMSF，重悬菌体，超声破碎菌体至液体呈清亮，分别取混合液(总蛋白)、离心后的上清(可溶性蛋白)、沉淀(不溶性蛋白)样品进行SDS-PAGE电泳分析，考马斯亮蓝染色，脱色后用蛋白凝胶成像分析仪进行拍照分析。

1.2.6 重组IL-2蛋白的纯化 用His标签蛋白纯化试剂盒进行目的蛋白纯化。待上样平衡后，使用咪唑浓度分别为50、80、100、120、150、180、200、220、250、300和500 mmol/L洗脱液进行洗脱，收集各组流出的洗脱液，经NanoDrop2000测定蛋白浓度并选取后面9个浓度的洗脱液进行SDS-PAGE分析。正式的洗脱步骤为：先用50 mmol/L咪唑洗脱杂蛋白，220 mmol/L咪唑洗脱目的蛋白，目的蛋白经超滤分子筛浓缩后将原来的buffer换成PBS。

1.2.7 重组蛋白Western blot鉴定 蛋白样品进行SDS-PAGE后将蛋白转印至PVDF膜，脱脂牛奶室温封闭4 h，分别加入1∶5 000稀释的His标记小鼠单克隆抗体，0.1 μg/mL浓度的IL-2山羊源多克隆抗体，于4℃孵育过夜，次日PBST洗膜4次，再分别加入1∶5 000稀释的HRP标记山羊抗鼠二抗或1∶5 000稀释的HRP标记驴抗羊的二抗，室温孵育1 h，PBST洗膜4次，DAB增强型试剂显色拍照。

1.2.8 IL-2抗病毒活性分析 使用细胞病变抑制法测定重组IL-2蛋白是否具备抗病毒活性。待24孔细胞培养板的MDBK细胞长至单层，IL-2处理组加入含终浓度为3 mg/mL重组蛋白的DMEM共同孵育24 h，次日弃培养液，每孔加入100 TCID50的BVDV溶液；病毒处理组只加100 TCID50的BVDV溶液；未处理组为正常MDBK细胞，不加IL-2与BVDV，72 h后镜检细胞病变情况。

2 结果

2.1 水牛IL-2基因的扩增及克隆产物的鉴定

以反转录得到的cDNA为模板，PCR扩增产物经琼脂糖凝胶分离可见大小约为500 bp的条带，与预期大小相符(图1)。序列分析显示，克隆的水牛IL-2基因ORF长468 bp，共编码155个氨基酸，与GenBank报道的印度水牛IL-2基因(登录号AF363786.1)核苷酸序列同源性为100%。

2.2 表达载体的构建

重组表达质粒pET-32a-IL-2的单菌落PCR产物经琼脂糖分离可见约1 200 bp条带(目的片断500 bp，加上载体测序引物扩增产物700 bp)，与预期结果相符(图2)。测序结果显示插入的IL-2基因大小、位置、阅码框架均正确，表明pET-32a-IL-2表达载体构建成功。

M.DNA标准DL 1 000；1.IL-2 基因扩增产物；2.阴性对照

M.DNA标准 DL 2 000；1～4.分别为挑选的不同pET-32a- IL-2菌落PCR

2.3 水牛IL-2蛋白的诱导表达与表达形式分析

水牛IL-2基因编码区序列共编码155个氨基酸，分子质量约为17 ku，连接到表达载体pET-32a用IPTG诱导表达。经SDS-PAGE分析显示，重组的IL-2蛋白在大肠埃希氏菌内表达较好，融合蛋白约为36 ku(包括标签蛋白在内)，重组蛋白主要以可溶性形式表达在上清，即为可溶性蛋白(图3)。

2.4 IL-2蛋白的纯化

重组IL-2 蛋白经纯化后，SDS-PAGE分析可见单一条带，可见得到纯度较高的IL-2重组蛋白(图4)。

2.5 重组蛋白Western blot鉴定

分别使用His标记单克隆抗体与山羊IL-2多克隆抗体行Western blot鉴定，在36 ku处有一特异条带，而对照空载体在此处没有出现相应条带，表明重组水牛IL-2蛋白反应原性良好，均能与His标签蛋白抗体和IL-2多克隆抗体发生特异性反应(图5A和图5B)。

M.蛋白分子量标准(15～130 ku)；1.pET-32a空载体；2.pET-32a-IL-2载体(未诱导)；3.pET-32a-IL-2载体(总蛋白)；4.可溶性蛋白；5.不溶性蛋白

M.蛋白Marker(11～245 ku)；1.pET-32a空载体；2.pET-32a-IL-2载体；3.纯化后的IL-2

2.6 重组蛋白的抗病毒活性分析

采用BVDV/MDBK细胞病变抑制评估纯化的IL-2抗病毒活性。结果显示，72 h后，处理组细胞出现典型的细胞病变，萎缩，空斑，脱落；IL-2处理组的细胞与未处理组相比，细胞出现少量病变，密度降低，存活的细胞边缘整齐、圆滑，可见纯化后的IL-2蛋白具有较好的抗病毒活性(图6)。

A.His标签抗体；M1.蛋白 Marker(11～245 ku)；1.pET-32a空载体；2.pET-32a-IL-2载体；B.IL-2多克隆抗体；M2.蛋白Marker(15～130 ku)；1.pET-32a空载体；2.pET-32a-IL-2载体

A.未处理组；B.病毒处理组；C.IL-2处理组A.Untreated group；B.Virus treatment group；C.IL-2 treatment group

3 讨论

水牛养殖业在广西发展迅速，流行性疾病的盛行必须引起重视，新型抗病毒药物的研发迫在眉睫。IL-2是一种对机体免疫应答和抗病毒感染有重要作用的细胞因子，获得具有活性的重组IL-2蛋白是实验基础。本试验通过原核表达载体pET-32a表达了水牛IL-2重组蛋白，目的蛋白主要以可溶性形式表达在上清，相比于包涵体蛋白，可溶性蛋白更好的保持了天然的活性，Western blot鉴定发现IL-2能与His标记单克隆抗体、IL-2多克隆抗体反应，表明IL-2重组蛋白具有良好的反应原性。

IL-2在牛感染性疾病中展现了较好的应用前景。IL-2因子增强牛对乳房炎[7]、结核病[8]、疱疹病毒感染[9]的抵抗力。同时，IL-2在牛机体内的分泌水平高低反映牛感染分枝杆菌的不同状态[15]。此外，以IL-2作为免疫佐剂达到增强疫苗的使用效果，Mingala等[16]给水牛注射口蹄疫灭活疫苗后，监测体内细胞因子的动态变化，发现IL-2在第2周达到峰值，暗示了IL-2与疫苗相互作用来影响抗病毒的过程；Wyckoff等[17]在感染布鲁杆菌牛身上同时使用重组牛IL-2蛋白与疫苗，牛机体的免疫应答增强，提高对布鲁杆菌的抵御能力。本试验在细胞水平上，将原核表达的IL-2蛋白经纯化、浓缩、置换缓冲液，与细胞培养液混匀作用于感染BVDV的MDBK细胞上；结果显示，IL-2蛋白具有抗BVDV对MDBK的作用。其中牛病毒性腹泻病毒呈世界性分布，感染后牛出现发热、腹泻、流产、死胎及畸形胎等症状，是影响牛产业发展的重要因素，新的抗病毒药物研发是做好疾病防控的重要手段。

IL-2是一种细胞因子，在抗病毒方面的应用相较于兽药、抗生素等其他药物优势在于对环境污染少、无残留，对流行性疾病的防治、生态环保的养殖有重要意义，其更多应用有待于研究者进一步探索。