不同日龄鸡喉黏膜组织中T淋巴细胞亚群的分布特点

杨树宝，张桂山，徐 晶，张英楠 ,3*

(1.吉林医药学院，吉林 132013；2.吉林农业大学动物科技学院，长春 130118；3.长春科技学院，长春 130600)

呼吸道直接与外界相通，是机体最先接触细菌、病毒等病原微生物的部位。呼吸道黏膜下的固有层内存在一些淋巴组织，构成了机体抵御外界病原微生物入侵的第一道免疫屏障，可提供对多种细菌和病毒等黏膜致病原侵袭的保护，这些淋巴组织被称为呼吸道相关性淋巴组织(respiratory-associated lymphoid tissue,RALT)，包括鼻黏膜相关淋巴组织(nasal-associated lymphoid tissue,NALT)、支气管相关淋巴组织(bronchus-associated lymphoid tissue,BALT)以及分布于喉和气管黏膜中的淋巴组织[1-3]。存在于这些淋巴组织中的T、B淋巴细胞是RALT的最重要的免疫细胞，对于局部及整个机体的免疫保护发挥重要作用。

课题组前期已经对不同日龄家禽的鼻、气管以及肺脏中的T淋巴细胞亚群的定位分布变化进行了报道[4-6]，并证明鼻、气管和肺脏中淋巴细胞的类型、定位分布以及数量都呈日龄相关性变化，而这些变化又可以反映呼吸道黏膜及机体的免疫状态。

喉作为呼吸道的重要组成部分，突出于呼吸系统和消化系统所组成的十字交叉处，由此定位的特殊性和重要性使其成为黏膜免疫的关键部位。喉腔内壁层是假复层柱状纤毛上皮，固有膜浅层有黏液性腺泡，其周围分布有淋巴组织。一方面流经鼻咽部的混于空气中的悬浮颗粒和病原菌一定会经过喉口进入气管或肺脏，另一方面，由支气管和气管所分泌的黏液也会经过喉口进入口咽部[7]。喉作为下呼吸道的门户，在呼吸道局部免疫中起到重要作用。

目前关于喉部淋巴组织的研究较少，仅有学者对人、牛和猪的喉部淋巴组织进行过研究报道[8-12]，但是对家禽至今还未见相关报道。本研究用免疫组织化学方法结合计算机图象分析技术观察不同生长发育阶段CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群在喉黏膜中的出现、组织定位和分布等，从而反映不同发育时期鸡喉黏膜的免疫状态，为进一步研究家禽喉黏膜的免疫机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 200枚海兰白鸡种蛋，购自长春净月潭旅游开发区银河养殖场，种蛋进行常规孵化，雏鸡进行常规饲养。

1.1.2 主要试剂 冰冻切片用OCT组织包埋液，美国Sakura公司产品；小鼠抗鸡CD4和CD8单克隆抗体，美国Southern Biotechnology公司产品；Ultra Sensitive SP超敏试剂盒kit 9901，福州迈新公司产品。

1.1.3 主要仪器 依爱EIF/C.DME3456 孵化机/出雏机，广东依爱孵化机厂产品；Leica CM1850 冰冻切片机，德国Leica公司产品；Olympus CX41 显微镜，日本Olympus公司产品；Pixera pro150ES图像采集器，美国Pixera公司产品。

1.2 方法

1.2.1 试验设计 200只试验用海兰白鸡种蛋进行孵化，鸡出壳后置于动物室中常规饲养。分别选择未经过疫苗免疫的18日、20日鸡胚，1、4、7、14、21、35、56日龄的雏鸡，每个时期随机选取3只鸡胚或雏鸡，颈部脱臼致死后取喉口至气管交界处的喉组织，并且将外表的喉肌去除，保留喉软骨及喉腔内部结构。

将上述组织按照取材和修块时的预定切面分别垂直置于冰冻切片OCT包埋液中包埋，液氮速冻后进行冰冻切片，片厚5 μm，置-80℃保存备用。

1.2.2 免疫组织化学染色程序 每张切片滴加30 mL/L过氧化氢，室温下孵育10 min；PBS洗3次，每次3 min；除去PBS，每张切片分别滴加小鼠抗鸡CD4和CD8单克隆抗体工作液，37℃孵育1 h；PBS洗3次，每次3 min；每张切片滴加聚合物增强剂(试剂A)，室温下孵育20 min；PBS洗3次，每次3 min；每张切片加酶标抗鼠/兔聚合物(试剂B)，室温下孵育30 min；PBS洗3次，每次3 min；DAB显色；苏木精复染；自来水冲洗返蓝；梯度酒精脱水；二甲苯透明；中性树脂封片；拍照。

1.2.3 图像分析及统计学处理 应用Image-pro plus 6.0图像分析软件测定喉黏膜中单位视野内阳性细胞面积。同一日龄选取3个样本，每个样本制作3张连续切片，每张切片10倍物镜下随机选取3个视野，取平均值。应用SPSSl 8.0软件对不同日龄的同一阳性细胞进行单因素方差分析。

2 结果

2.1 胚胎期及出壳后1～14日龄鸡喉黏膜组织中CD4+ 和CD8+ T淋巴细胞的分布

免疫组化染色的图片中着色为棕色的细胞判定为阳性细胞，并通过计算阳性细胞的面积对相对数量进行比较分析。

胚胎20日龄和出壳后1日龄时，喉黏膜中没有CD4+和CD8+T淋巴细胞出现。4日龄时，CD4+和CD8+T淋巴细胞都首次出现在喉黏膜中，而且都主要分布在喉腔底壁的正中黏膜嵴中(图1A，图1B)，此时CD4+T淋巴细胞的数量显著低于CD8+T淋巴细胞(P<0.05)(图2)。

7日龄时，喉黏膜中CD4+和CD8+T淋巴细胞的数量都显著增加(P<0.05)(图2)，而且在喉黏膜中形成淋巴聚集物，其表面仍被假复层柱状纤毛上皮所覆盖，CD4+和CD8+T淋巴细胞都主要分布在淋巴聚集物的中下部区域，而且主要以CD4亚群为主(图1C)，而CD8亚群相对较少(图1D)。

14日龄时CD4+T淋巴细胞的数量增加，而CD8+T淋巴细胞下降，但与7日龄比较差异均不显著(P>0.05)，同时CD4+T淋巴细胞的数量显著高于CD8+T淋巴细胞(P<0.05)(图2)。此时喉黏膜中大的淋巴聚集物不多，而是淋巴细胞散布在几乎所有部位的喉黏膜固有层中，局部形成小的淋巴聚集物，其中CD4+T淋巴细胞分布较集中(图1E)，而CD8+T淋巴细胞较分散，但分布范围较广，黏膜上皮中也有CD8+T淋巴细胞存在(图1F)。

2.2 21～56日龄鸡喉黏膜组织中CD4+ 和CD8+ T淋巴细胞的分布及数量变化

21日龄时，喉黏膜固有层中淋巴细胞更为集中，CD4+T淋巴细胞集中在黏膜固有层中下部区域(图1G)，而CD8+T淋巴细胞与14日龄时相似，分散在整个黏膜固有层中，黏膜上皮内也有个别CD8+T淋巴细胞存在。此时，CD4+T淋巴细胞的数量继续增加，并显著高于14日龄(P<0.05)，而CD8+T淋巴细胞无明显变化，因此CD4+T淋巴细胞的数量更显著高于CD8+T淋巴细胞(P<0.05)(图2)。

35日龄时，在喉口处黏膜口腔面复层扁平上皮下的固有层黏液腺周围也出现较大的淋巴聚集物，而且也是以CD4亚群为主，并占据聚集物的中央(图1H)。此时，CD4+T淋巴细胞的数量仍继续增加，但与21日龄比较差异并不显著(P>0.05)，而且CD4+T淋巴细胞仍显著多于CD8+T淋巴细胞(P<0.05)，与14日龄和21日龄相似，CD4+T淋巴细胞的数量大概是CD8+T淋巴细胞的两倍(图2)。

56日龄时，CD8+T淋巴细胞的数量急剧增加，并且大量分布在生发中心周围的滤泡间区域(图1I)，此时数量与CD4+T淋巴细胞接近，两者比较差异不显著(P>0.05)(图2)。

A.4日龄(250×)，箭头：正中黏膜嵴中的CD4+细胞；B.4日龄(250×)，箭头：正中黏膜嵴中的CD8+细胞；C.7日龄(100×)，箭头：淋巴聚集物中的CD4+细胞；D.7日龄(100×)，箭头：淋巴聚集物中的CD8+细胞；E.14日龄(250×)，箭头：淋巴聚集物中的CD4+细胞；F.14日龄(250×)，箭头：淋巴聚集物中的CD8+细胞；G.21日龄(250×)，箭头：黏膜固有层中下部的CD4+细胞；H.35日龄(250×)，箭头：口腔面复层扁平上皮下固有层黏液腺周围的淋巴聚集物；I.56日龄(250×)，细箭头：滤泡间区域中的CD8+细胞；粗箭头：生发中心

3 讨论

动物的喉一直以来被认为只是呼吸管道中一个惰性机械瓣膜，气体通过的一个阀门，与免疫关联并不大。然而，对人和动物的研究表明，喉黏膜中确实存在大量的淋巴组织，这些淋巴组织其中一部分是以淋巴上皮滤泡的形式存在，即为喉黏膜相关淋巴组织(LALT)，而且呈现年龄和疾病依赖性变化。除比较集中的LALT以外，与肠道和气管黏膜一样，大多数免疫活性细胞呈弥漫性存在于喉黏膜中，但也有小的淋巴聚集物存在[8-12]。

本研究发现，鸡14日龄时喉黏膜中大的淋巴聚集物不多，而是CD4+和CD8+T淋巴细胞散布在几乎所有部位的喉黏膜固有层中，局部形成小的淋巴聚集物，其中CD4+T淋巴细胞分布较集中。另外，56日龄时，喉黏膜中出现主要由生发中心构成的淋巴滤泡，并且CD4+和CD8+T淋巴细胞分布在生发中心周围的滤泡间区域，从而也形成典型的LALT。

同一日龄肩标*表示差异显著(P<0.05)，无*标注表示差异不显著(P>0.05)；不同日龄同一种细胞肩标不同字母表示差异显著(P<0.05)，肩标相同字母表示差异不显著(P>0.05)

本研究与其他学者对人和其它哺乳动物对喉淋巴组织的研究结果较一致，均发现喉黏膜中的LALT以及弥散性的淋巴细胞及组织均呈现日龄相关性变化[8-13]，如对人的研究发现，年龄小于20岁时，LALT较20岁以上的人更为发达[13]；犊牛会厌软骨以及杓状软骨黏膜中的LALT较为发达，而且随着日龄增长，LALT越来越发达[8]。

本研究发现，从4日龄时CD4+和CD8+T淋巴细胞在喉黏膜中首次出现，一直到56日龄时，CD4+和CD8+T淋巴细胞都主要分布在喉腔底壁的正中黏膜嵴中，随着日龄增长CD4+T淋巴细胞的数量逐渐增加，而CD8+T淋巴细胞的数量变化不大。这些淋巴细胞之所以能都集中出现在喉腔底壁的正中黏膜嵴，其原因可能是此处位置较低，喉腔中的黏液更多的汇集于底壁，因此此处黏附空气中的病原菌和颗粒物能力较强，另外正中黏膜嵴在此处突出，与经过喉口进入喉腔的气体接触频繁，因此接触病原的机率较大，并且此处的黏膜较厚，固有层中血管等较发达，从而使免疫细胞较易在此处定植，从而行使免疫功能。

Casteleyn等[8]对犊牛的研究发现，在喉的会厌和杓状软骨突起部分的黏膜中存在大量的淋巴滤泡。犊牛喉腔中这些突起部位存在大量淋巴组织恰好与本研究发现的在鸡喉腔底部突起的正中黏膜嵴中存在淋巴聚集物相似，也主要是由于这些突出部位会与经过喉口进入喉腔的气体频繁接触，因此接触病原的机率较大，从而使免疫细胞较易在此处定植，形成较为发达的淋巴组织。

Barker等[12]对猪喉黏膜淋巴组织的研究发现，喉黏膜上皮和固有层中均出现以T淋巴细胞为主的淋巴聚集物体，CD4+和CD8+T淋巴细胞虽然同时存在于所有部位，但数量差别较大，声门下区域黏膜中CD4+T淋巴细胞明显多于CD8+T淋巴细胞，这与本研究发现的在正中黏膜嵴中CD4+T淋巴细胞明显多于CD8+T淋巴细胞的结果较一致，鸡的正中黏膜嵴和猪的声门下区域的黏膜位置均较低，黏附空气中的病原菌和颗粒物能力较强，从而使B淋巴细胞较易在此处定植产生相应抗体执行体液免疫应答，而更多的CD4+T淋巴细胞会募集于此，辅助B淋巴细胞参与免疫应答。