猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp12的原核表达及间接ELISA方法的建立

张小波，冯 鹏，赵 钦，

(西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌 712100)

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是猪的一种急性的高度接触性传染病，此病因导致猪耳朵发绀，俗称为“蓝耳病”。PRRS自1987年首次报道以来[1]，一直是危害养猪业的重要传染病，造成了巨大的经济损失[2]。疫苗接种是预防该病的重要手段之一，目前报道，除了传统的灭活疫苗和弱毒疫苗，还有新型的核酸疫苗[3]。PRRS的病原为猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)，PRRSV在流行过程中不断变异[4-6]，为PRRS的防控带来了严重的挑战。建立快速诊断PRRSV野毒感染方法对于防控PRRS具有重要意义。

Nsp12为PRRSV的非结构蛋白，由153个氨基酸组成，分子质量为17 ku，位于ORF1b的末端。Nsp12能够利用宿主细胞的HSP70来促进病毒的复制[7]，因此，Nsp12是参与PRRSV复制的重要非结构蛋白[8]。由于Nsp12只在病毒的复制周期表达，因此，Nsp12抗体只能在具有感染性的PRRSV感染猪只中才能被检测到。研究表明，Nsp12具有保守的B细胞抗原表位[9]，能够诱导机体产生抗体，可以作为检测PRRSV野毒感染的指标。因此，本研究采用原核表达系统表达PRRSV的非结构蛋白Nsp12，利用表达的蛋白包被ELISA板，建立检测血清中抗Nsp12的抗体的方法，为检测猪场PRRSV野毒感染情况，净化PRRS提供技术保障。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 血清 抗PRRSV的阳性血清和阴性血清，由西安市灞桥区动物疾病预防控制中心兽医实验室保存；92份血清样品，通过联系不同猪场采集获得，血清样本采集的猪场均有免疫记录，且部分血清采集的猪只疑似PRRSV感染。

1.1.2 主要试剂 原核表达载体pET-32a(+)、E.coliDH5α工程菌和E.coliBL21(DE3)工程菌，由西安市灞桥区动物疾病预防控制中心兽医实验室保存；KoD-Plus高保真酶、用于合成cDNA第一链的反转录试剂盒，东洋纺(上海)生物科技有限公司产品；普通rTaq 酶与dNTPs，宝生物工程(大连)有限公司产品；EcoRⅠ和XhoⅠ限制性内切酶、T4 DNA连接酶，赛默飞世尔科技(中国)有限公司旗下Fermentas产品；DNA凝胶回收试剂盒(E.Z.N.A®Gel Extraction Kit Ⅰ)和小量质粒抽提试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司产品；HisTrap FF crude 1 mL预装柱，GE公司产品；RNA抽提试剂盒，美基(Magen)生物技术公司产品；抗6×His单克隆抗体与HRP标记羊抗鼠IgG，合达生物公司产品；辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗猪IgG，索莱宝生物技术有限公司产品；PRRS X3检测试剂盒，IDEXX公司产品；四甲基联苯胺(TMB)，碧云天生物技术公司产品。

1.1.3 主要仪器 酶标仪(Bio-RAD 680)、PCR仪(T100)，美国伯乐(Bio-Rad)公司产品；超微量分光光度计(NanoDrop2000)，赛默飞世尔科技(中国)有限公司产品；凝胶成像系统(1600)、化学曝光仪(Tanon6600)，上海天能公司产品；电热恒温水槽(DK-8D)，上海一恒科技有限公司产品；超净工作台(VD-850)，苏州净化设备有限公司产品；高速冷冻离心机(5418R)，Eppendorf(中国)有限公司产品；电子分析天平(BSA2201)，德国Sartorius公司产品。

1.2 方法

1.2.1 目的基因扩增与克隆 根据NCBI上PRRSV A2MC2毒株Nsp12基因序列(GenBank No.KX462792.1)，设计一对扩增Nsp12的引物：Nsp12-F：5′-cacgaattcggtcgctatttcacctggtatc-3′(下划线处为EcoRⅠ酶切位点)；Nsp12-R：5′-cccctcgagattcaggcctaaagtt-3′(下划线处为XhoⅠ酶切位点)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

从某猪场采集疑似PRRS病猪胎盘、血清和肺组织等，将采集的组织剪碎，于含有PBS的研钵中利用石英砂进行组织研磨，将研磨液反复冻融3次后，12 000 r/min、4℃离心10 min，收取上清，参照试剂盒说明书，利用HiPure Universal RNA Kits(Magen)试剂盒提取RNA，然后以抽提的RNA为模板，参照东洋纺(上海)生物科技有限公司的高效逆转录酶试剂盒ReverTra Ace的说明书进行cDNA第一链的合成，合成引物为随机引物。

以合成的cDNA为模板，利用KoD-Plus高保真酶通过PCR扩增Nsp12基因，使用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切PCR产物和质粒pET-32a(+)，分别回收目的片段和载体质粒，用T4 DNA连接酶连接后转化E.coliDH5α感受态细胞，在含有氨苄青霉素的LB平板上筛选阳性克隆，扩大培养后，提取重组质粒，使用EcoRⅠ和XhoⅠ进行双酶切鉴定。经双酶切鉴定为阳性的重组质粒送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序，测序正确的质粒命名为pET32-Nsp12。

1.2.2 目的基因的表达、纯化与鉴定 将重组质粒pET32-Nsp12和空载体pET-32a(+)转化E.coliBL21(DE3)感受态细胞，在含有氨苄青霉素的LB平板上筛选阳性克隆，挑取阳性菌于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD600值为0.5，再加入IPTG至终浓度为1.0 mmol/L，诱导Nsp12的表达，于37℃继续培养12 h，取出菌液进行SDS-PAGE分析。然后进行IPTG浓度和诱导时间的优化，确定Nsp12表达的最佳诱导条件。按照最佳诱导条件，将诱导表达的菌液离心，收集菌体超声裂解，离心后分别收集上清和沉淀进行SDS-PAGE分析，确定Nsp12蛋白的主要表达形式。将表达的Nsp12蛋白使用HisTrap FF亲和层析柱进行蛋白纯化，纯化后的Nsp12利用His-Tag标签抗体和抗PRRSV的阳性血清进行Western blot，蛋白Marker和免疫印迹分别通过天能ECL化学发光仪的白光拍摄和曝光拍摄，然后分析鉴定重组Nsp12蛋白。

1.2.3 基于Nsp12蛋白的检测PRRSV抗体的间接ELISA方法的建立 使用Thermo Fisher公司的Nanodrop 2000微量分光光度计测定纯化的Nsp12重组蛋白浓度，用PBS稀释的Nsp12重组蛋白进行包被，4℃过夜；用100 mL/L FBS进行封闭，37℃孵育1 h；PBST洗涤3次；分别加入1∶50稀释的PRRSV阴性和阳性血清，37℃孵育1 h；PBST洗涤3次；加入1∶5 000稀释的HRP标记的羊抗猪IgG，37℃孵育1 h；PBST洗涤3次；然后加入底物液TMB，室温避光反应10 min；用2 mol/L H2SO4终止反应，酶标仪测定OD450值。通过棋盘法优化抗原包被浓度和血清稀释度、封闭液种类和稀释度、血清反应时间和温度，建立检测PRRSV抗体的间接ELISA方法。抗原包被浓度分别稀释为0.5 mg/L、1.0 mg/L、2.0 mg/L、4.0 mg/L、8.0 mg/L、16.0 mg/L共6个梯度；血清作1∶1、1∶5、1∶25和1∶125稀释；封闭液种类和稀释度为：10、30、50 g/L BSA，50、100 mL/L FBS，10、30、50 g/L脱脂奶粉；血清反应时间分别设置30、60、90、120 min；温度选择25℃(室温)和37℃。

1.2.4 Nsp12-ELISA方法阴阳性临界值判定实验 按照上述确定的最优条件建立的检测Nsp12抗体的间接ELISA方法检测30份PRRSV阴性猪血清，依据公式：临界值=阴性对照OD450 nm (平均值)+3×标准方差(SD)确定检测方法的临界值。

1.2.5 与IDEXX试剂盒比较 收集临床血清样品92份，利用IDEXX的试剂盒检测(PRRS X3)和建立的间接ELISA方法进行PRRSV抗体检测。 将检测结果进行分析比较。

2 结果

2.1 重组质粒pET32-Nsp12的构建和鉴定

通过RT-PCR从PRRSV疑似样本中扩增得到Nsp12基因(图1)。将Nsp12基因通过酶切连接克隆至pET-32a(+)原核表达载体，使用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切重组质粒pET32-Nsp12(图2)，将双酶切鉴定阳性的质粒进行测序，将测定序列在NCBI上进行比对，发现扩增得到的Nsp12基因与近几年流行的PRRSV PRR71566-S9-L001、SD95-21、RVRp22和YN-2011等毒株的Nsp12基因完全匹配；与PRRSV A2MC2毒株的Nsp12序列进行比对，只有403位点的G突变为A。以上结果表明，原核表达Nsp12重组质粒构建成功。

M.DNA标准DL 2 000；1.Nsp12基因PCR产物；2.阴性对照

M1.DNA标准DL 15 000；M2.DNA标准DL 2 000；1.pET32-Nsp12质粒双酶切产物

2.2 Nsp12基因的诱导表达与鉴定

将重组质粒pET32-Nsp12转化至原核表达宿主菌E.coliBL21(DE3)(含融合蛋白和标签蛋白)，使用IPTG诱导细菌表达Nsp12重组蛋白，SDS-PAGE分析发现，在预期大小位置40 ku处有明显的蛋白条带，而转化的空载体pET-32a(+)的样品没有，确证Nsp12蛋白获得表达(图3)。通过对表达条件的优化，结果显示，最佳的IPTG浓度为0.5 mmol/L，最佳诱导温度为37℃。按照最佳诱导条件，诱导细菌表达Nsp12重组蛋白，收集菌体进行超声破碎，离心收集上清和沉淀，SDS-PAGE分析，结果发现，目的蛋白主要存在于沉淀中，表明Nsp12重组蛋白以包涵体的形式表达。使用尿素溶解包涵体后，利用镍柱进行亲和层析纯化并收集纯化的Nsp12蛋白，利用His-tag单抗和PRRSV阳性血清通过Western blot对纯化的蛋白进行鉴定，结果显示，表达的重组蛋白能够被His-tag单抗识别(图4)，且表达的Nsp12蛋白能够与PRRSV阳性血清发生特异性反应(图5)。表明获得的Nsp12蛋白具有良好的反应原性。

M.蛋白标准；1.未经IPTG诱导的pET32-Nsp12；2.经IPTG诱导的pET-32a(+)空载体对照；3.经IPTG诱导表达的pET32-Nsp12

M.蛋白标准；1.IPTG诱导空载体对照；2.IPTG诱导的表达产物；3.未经IPTG诱导的pET32-Nsp12

2.3 检测PRRSV抗体的间接ELISA方法的建立及阴阳性临界值确定

使用纯化的重组Nsp12蛋白作为抗原建立检测PRRSV抗体的间接ELISA方法。通过对建立的ELISA方法的优化，确定了Nsp12蛋白的最佳包被浓度为4.0 mg/L，最佳血清稀释度为1∶25，最佳封闭液为50 g/L的BSA，血清的最佳反应温度为37℃，最佳反应时间为60 min。按照优化的条件建立检测Nsp12抗体的间接ELISA方法，利用此方法检测本单位实验室保存的30份PRRS阴性血清(由IDEXX试剂盒检测确证)，计算出阴性血清的OD450 nm的平均值为0.098，SD=0.043，因此，确定阴阳性临界值为OD450nm 0.227。

M.蛋白标准；1.IPTG诱导的表达产物；2.IPTG诱导空载体对照；3.未经IPTG诱导的pET32-Nsp12

2.4 Nsp12间接ELISA与IDEXX试剂盒的比对

收集不同猪场的92份临床血清样品(所有猪场均有免疫PRRS疫苗记录，且部分样品采集的猪只疑似感染PRRSV)。同时使用IDEXX的试剂盒和本研究建立的间接ELISA对92份血清样品进行检测。IDEXX试剂盒检测结果显示，有87份血清检测结果阳性，5份为阴性；Nsp12 间接ELISA检测结果显示，有32份为阳性，60份为阴性，阳性符合率为36.78%(32/87)，阴性的符合率为100%(5/5)，有55份样品和IDEXX的检测结果不一致(59.78%不符合率)。此外，Nsp12 间接ELISA检测的32份阳性均为IDEXX检测的高阳性样本。

3 讨论

目前PRRS依然是危害我国养猪业的重要传染病，通过血清学监测可以有效净化阳性猪场。监测PRRSV抗体的主流手段为IDEXX的ELISA试剂盒，抗体检测精确度较高，但是无法有效区分野毒和疫苗诱导产生的抗体。因此，筛选合适的检测PRRSV野毒抗体的抗原一直是PRRSV血清学研究的一个重要方向。Nsp12蛋白作为非结构蛋白，对病毒的复制发挥多种功能[10-12]，且能够诱导抗体产生，能够作为检测PRRSV野毒抗体的理想抗原。本研究选用原核表达系统对Nsp12蛋白进行表达，其优点是蛋白表达量较高，成本低，且表达的Nsp12的反应原性较好，对于后续建立检测方法没有影响。ELISA检测血清抗体具有高通量、敏感性高、操作简单等优点，被广泛应用于抗体水平的检测。本研究利用PRRSV的非结构蛋白建立的间接ELISA方法主要用于检测PRRSV活毒感染诱导产生的抗体水平，因此，如果猪场使用的灭活PRRSV疫苗对猪进行免疫，则无法检测疫苗诱导产生的抗体水平。通过与IDEXX试剂盒的对比分析发现，本研究建立的检测PRRSV抗体的ELISA方法与其符合率并不是太高，两种方法检测结果中阳性血清份数差异很大，其原因可能是IDEXX的试剂盒可以检测到疫苗诱导产生的抗体，而本研究建立的间接ELISA方法只能检测到活PRRSV感染诱导产生的抗体。因此，本研究建立的ELISA检测阳性率远远不如IDEXX的试剂盒。但是本研究建立的ELISA方法检测的阳性血清均是IDEXX检测出的超高阳性的血清，这也从侧面说明了本研究建立的ELISA可能检测到的是活毒PRRSV感染的抗体。对于阴性血清，则是100%的符合，说明本研究建立的ELISA方法对阴性血清不会产生假阳性。总的来说，本研究建立的ELISA方法对于检测PRRSV活毒感染诱导产生的抗体具有一定的应用价值，可为检测猪场PRRSV感染提供工具。