基于RNA-Seq数据分析端粒酶对牛乳腺上皮细胞重编程进程的影响

姜欣颖，马利兵，杨 慧，曲 静，仉亚利，贺小英*

(1.内蒙古科技大学生命科学与技术学院，内蒙古包头 014010；2.内蒙古赤峰市敖汉旗新惠中学生物组，内蒙古赤峰 024300)

体细胞重编程是指将已经分化的体细胞通过一定的技术手段将其逆转到多能性或全能型状态的过程[1]。自2006年诱导多潜能干细胞(iPS)报道以来，细胞重编程成为了当今生物学领域研究热点,细胞核重编程研究的意义在于不仅能够解决体细胞克隆技术问题，也是解析生物体胚胎发育、衰老和癌症等发生机制的有效途径，是未来动物改良育种、人类不孕不育及再生医学等领域中最具应用价值的一项前沿技术。由于细胞重编程是一个复杂的调控过程,目前仍然有大量的问题尚待解决。其中细胞重编程效率低下是最主要的问题，主要原因可能是细胞重编程机制还不清楚。大量研究证实，体细胞的端粒是导致细胞重编程不彻底的关键因素[2]。端粒是染色体末端的重复序列，在细胞中对于维持染色体的稳定性和基因的完整性具有重要作用[3]。与体细胞相比，生殖细胞因端粒酶的表达能维持其端粒的长度。端粒酶是能够在细胞中延长端粒的一种酶，人端粒酶逆转录酶(hTERT)是端粒酶组分中的一个重要的亚结构，它的表达水平直接影响端粒酶活性[4-5]。端粒酶的活性在生物体内严格受到调控，仅在生殖细胞、永生化细胞、胚胎干细胞和肿瘤细胞中才能够检测到端粒酶的活性[6]。越来越多研究表明，端粒和端粒酶在细胞生长、发育分化以及细胞重编程方面起重要作用。有学者发现，在细胞生命进程活动中hTERT有转录调控和代谢重编程的功能[7]。Blasco及其研究团队在2009年的《Nature》杂志上报道，当供体细胞缺失端粒酶活性会阻碍细胞重编程的发生[8]。

为了探究端粒酶在细胞重编程方面的重要调控作用，本研究构建了一个携带端粒酶基因的供体细胞模型，目的是当供体细胞经过端粒酶修饰后，供体细胞水平是否有利于提高重编程效率，为进一步探究细胞重编程调控机制提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 DMEM/F12基础培养液、胎牛血清(FBS)，美国Gibco公司产品；2.5 g/L胰酶，北京索莱宝科技有限公司产品；酶联免疫分析测试剂盒，上海酶联生物科技有限公司产品；提取蛋白试剂盒，南京凯基生物科技发展有限公司产品；荧光定量试剂盒，宝生物工程(大连)有限公司产品；基因组提取试剂盒、DNA Marker，天根生化科技(北京)有限公司产品。

1.1.2 主要仪器 二氧化碳培养箱(Galaxy S)，RS BIOTECH 公司产品；荧光倒置显微镜(AE30/31+)，日本尼康株式会社产品；电泳仪(Tanon EPS 300)，上海天能科技有限公司产品；PCR仪(BSW-3T)，上海启步生物科技有限公司产品；转膜电泳槽(Tanon VE-586)，上海天能科技有限公司产品；凝胶成像仪(THZ-C-1)，美国Gene Genius公司产品；制冰机(华豫兄弟 XD-100kg)，华豫兄弟(深圳)制冰系统有限公司产品；酶标仪，Thermo Fisher 公司产品。

图1 腺病毒载体结构示意图

1.2 方法

1.2.1 阳性细胞的制备 将牛乳腺上皮细胞以1×105个/ mL浓度接种于培养皿中，当细胞汇合率达到30%左右且细胞生长状态良好、形态正常时利用腺病毒进行细胞转染，感染复数(MOI)分别设为 20、40、60、80、100，根据设定的MOI值，将病毒液进行稀释加入到细胞培养基中，感染72 h用倒置显微镜观察细胞生长状态并用流式细胞仪进行转染效率检测，将筛选得到的阳性细胞用于后续试验。

1.2.2 hTERT在细胞中的表达情况检测 对于筛选得到的细胞首先利用RT-PCR和Western blot鉴定hTERT在细胞中的表达情况，当细胞密度为90%左右时，将细胞用PBS清洗，一方面采用 Trizol法提取细胞总RNA，反转录合成cDNA，用RT-PCR检测hTETR的表达情况；另一方面加入细胞裂解液裂解细胞，提取细胞总蛋白，进行Western blot检测。

1.2.3 端粒酶活性检测 用人端粒酶ELISA方法检测阳性细胞的端粒酶活性，反复冻融使细胞裂解，仔细收集上清。后续试验步骤参照端粒酶酶联免疫检测试剂盒说明书进行，首先标准品孔各加不同浓度的标准品50 μL，空白孔不加样品，每孔加入酶标试剂100 μL，空白孔除外。37℃温育60 min后进行洗涤和显色，最后以空白孔调零，终止后15 min内检测450 nm波长处各孔的吸光度(OD450值)。

1.2.4 细胞周期检测 细胞转染72 h后，收集细胞，PBS清洗细胞，离心弃上清，加入1 mL预冷750 mL/L乙醇，4℃过夜固定。离心弃上清，加入500 μL碘化丙啶染色液，充分重悬细胞沉淀，室温避光孵育30 min后，用流式细胞仪进行细胞周期检测。

1.2.5 端粒酶修饰后细胞转录组测序分析 样品分别为腺病毒和空病毒处理组，提取细胞总RNA，每组送测3个平行样，样品质检合格后，通过Illumina测序平台对细胞样本进行文库构建与序列测定工作。本试验的转录组测序由南京派森诺公司完成。

1.2.6 数据统计分析 所有试验都是3个平行重复，数值以平均值±标准差(SD)表示。采用单因素方差分析进行比较组间的显著性，显著性表示为P<0.05、P<0.01和P<0.001，当P<0.05时认为有统计学意义。

1.2.7 RT-qPCR数据分析 为验证基于RNA-Seq的转录组分析的准确性并了解端粒酶调控细胞重编程的分子机制，选择了8个差异显著的基因进行定量实时PCR。引物如表1，反应条件为：95℃ 30 s后，在95℃下进行40个循环，退火温度为55℃～60℃，然后在95℃下退火15 s，60℃下退火1 min，然后在95℃下退火15 s，数据用2-△△Ct法分析，以β-肌动蛋白为参比基因。试验进行了3次。

表1 荧光定量PCR引物信息

2 结果

2.1 细胞转染效率及目的基因表达检测

转染效率检测结果表明，当MOI为80时，细胞转染效率最高且细胞生长状态良好(图2)。对于筛选得到的细胞进一步检测目的基因hTERT的表达情况，RT-qPCR和Western blot结果表明(图3)，hTERT在阳性细胞中表达，以转空病毒载体的细胞为对照hTERT不表达。

图2 不同MOI条件下乳腺上皮细胞转染效率(100×)

2.2 阳性细胞端粒酶活性检测

由端粒酶活性检测试剂盒中设定的端粒酶活性检测方程(图4)计算可知， MOI为80时，阳性细胞端粒酶活性为18.905 75 ng/mL(表2)，此端粒酶活性最高。结果表明，MOI为80时，获得阳性细胞可用于后续研究。

A.hTERT的RT-PCR鉴定：1.DNA Marker；2.hTERT；3,5.内参；4.不携带hTERT空病毒的对照组；6.模板以水为对照.B．hTERT 的Western blot鉴定

图4 端粒酶活性检测方程

2.3 细胞周期

细胞周期结果显示(图5)，过表达端粒酶能够促进阳性牛乳腺上皮细胞由G1期向S期转变，从而提高细胞增殖活力。结果表明，供体细胞经端粒酶修饰有利于细胞重编程进程。

图5 细胞周期检测结果及统计

2.4 端粒酶修饰后的供体细胞基因表达模式分析

2.4.1 端粒酶修饰与未修饰的供体细胞差异基因表达分析 通过RNA-seq试验检测端粒酶修饰处理和未修饰的供体细胞之间的差异表达基因，结果显示共有990个差异表达基因(图6A)，其中250个上调基因和740个下调基因 。双向聚类分析表明结果可靠(图6B)，3个生物学重复的差异表达基因相似，而组间处理的差异表达基因差异显著。

A.DEGs火山分布图;X轴表示log2变换后的折数变化;Y轴表示-log10改变的变化;(XS表示转端粒酶基因组，Xd表示对照组)；B．差异表达基因的聚类分析

2.4.2 差异表达基因功能分析 对差异表达基因进行GO功能分类分析，结果显示差异基因主要与各级细胞、组织、器官及个体发育进程有关(图7A)，这些基因的表达在一定程度上决定了供体细胞是否有利于细胞重编程效率的提高(表2)。KEGG通路分析有助于进一步了解基因的生物学功能，通过通路显著性富集能确定差异表达基因参与的最主要生化代谢途径和信号转导途径，KEGG通路分析显示差异基因主要参与调控乳腺上皮细胞多种生物学功能及细胞发育，且能够激活PI3K-AKT 、Wnt及Focal adhesion等信号通路(图7B)。

A.GO富集分析柱状图;B KEGG富集分析气泡图A.GO enrichment analysis bar chart; B.KEGG enrichment analysis bubble chart

表2 不同MOI感染复数细胞的端粒酶活性检测

2.4.3 RT-qPCR验证RNA-Seq数据 为了验证RNA-seq结果，选取了部分差异表达基因进行RT-qPCR验证。如图8所示，通过RNA-seq和RT-qPCR鉴定检测到的与细胞重编程进程有关的目的基因表达水平和mRNA的上调或下调趋势一致。

图8 使用RT-qPCR验证部分差异表达基因

表3 与细胞、胚胎发育相关基因的筛选

3 讨论

体细胞重编程属于一个复杂的调控过程，供体细胞对细胞重编程的进程具有重要的影响。理论上，具备完整基因组的所有供体细胞核都有发育的全能性，且都能发生细胞重编程。但是，体细胞作为细胞重编程供体效率低的原因可能与细胞类型、端粒酶活性等有关，哪种细胞类型更适合作为供体细胞，仍然没有定论。总体来看，学者大多认为来源于生殖系统的细胞，例如卵丘细胞和颗粒细胞等，更有利于提高细胞重编程[9]。这可能与生殖细胞发育进程更有利于细胞重编程有关。1997年和2010年，分别成功获得世界首例克隆羊“dolly”和克隆羊“dolly二代”，都是利用乳腺上皮细胞作为供核体细胞，由于乳腺细胞在哺乳动物的生理周期和怀孕期，会周期性地发生一系列生长、发育、分化、凋亡等生命活动，这极有可能是维持乳腺细胞发育特性过程的某些基因或信号通路更有利于活化细胞重编程的进程。因此，本文采用牛乳腺上皮细胞作为供体细胞，当其经端粒酶修饰后，目的是增加供体细胞的端粒酶活性来增加端粒长度，进一步鉴定其基因表达模式是否有利于提高细胞重编程进程。结果表明，当MOI为80时，转染效率最佳且测定的端粒酶活性大约为精子的2倍，细胞周期结果显示无异倍体出现，且促进细胞增殖。以上结果表明体外研究模型构建成功，且为细胞重编程提供了一个有良好遗传背景的供体细胞。

细胞的重编程是通过改变供体细胞状态从一种基因表达谱转换成新型的表达谱，从而实现细胞类型转化的过程。因此，供体细胞基因表达谱的调控变化在细胞重编程进程中起到关键作用。

本研究利用高通量测序结果证实，当供体细胞经端粒酶修饰后，有740个下调基因，有250个上调基因，其中属于生长因子、促进细胞增殖的有VEGF、IGFBP3、PDGFD等，分化因子有GDF15，调节胚胎发育的基因有PGF、IGF2、PDGFRB和SEMA3C；调节细胞生长的有FYN、KDR，调节细胞分裂周期的有CDCA7等。这些基因在细胞及个体的生长发育中起重要调控作用。

有研究表明，VEGF、IGFBP3、PDGFD参与细胞分化、增殖和凋亡，在细胞和生物体的发育生长调节中起重要作用[10-11]，FYN-酪氨酸蛋白激酶在许多生物学过程中起作用，包括调节细胞生长和存活[12]，PGF是生长因子，活跃于血管生成和内皮细胞生长，刺激其增殖和迁移。它也是胎盘生长的相关因子[13]，在哺乳动物中，IGF2是一个印迹基因，在调节胎盘发育中起关键作用[14],PDGFRB属于酪氨酸蛋白激酶家族，调节胚胎发育、细胞增殖、存活、分化、趋化性和整联蛋白介导的信号传导， SEMA3C 在胚胎发生过程中正常心血管发育所必需[15]。这些基因通过相互作用共同调控细胞及个体的生长发育，使其更有利于提高重编程效率。这一结论也能在GO和KEGG显著富集的基因分析中得到证明。GO分析显示，这些受 hTERT调 控 的 基 因 主 要 涉 及 与细胞及个体发育调控过程相关。

另外一些重要细胞信号通路的激活可以促进体细胞重编程进程，本研究通过对KEGG信号通路分析发现，PI3K-Akt、Wnt等信号通路被激活，其中PI3K-Akt是一种广泛存在所有细胞中的信号通路，胚胎干细胞的自我更新和分化潜能都与其密切相关[16]。

Wnt 信号通路在细胞增殖、细胞极性以及胚胎发育等生物过程中都起到了重要作用，激活Wnt信号通路可以促进iPS细胞的诱导，Wnt3a 蛋白的外源加入也对重编程的发生有促进作用[17]。这说明供体细胞经端粒酶修饰后其转录组的基因表达谱水平有利于提高重编程的效率，初步证实了供体细胞端粒酶活性与细胞重编程调控之间的关系。