新疆阿克苏地区某奶牛场温氏支原体感染状况的调查

张秀萍，郎 平，姜 云,2*，罗慧丽，赵爱云，陈宏伟 ，齐 萌*

(1.塔里木大学动物科学学院/新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室，新疆阿拉尔 843300；2.新疆生产建设兵团第二师畜牧兽医工作站，新疆铁门关 841023)

温氏支原体(Mycoplasmawenyonii)是引起牛嗜血支原体病的主要病原之一，多引起牛贫血、黄疸、发热和消瘦等症状，对养牛业造成一定的危害[1]。由M.wenyonii引起的奶牛嗜血支原体病各季节均有发生，可导致奶牛产奶量下降、生长发育受阻、饲料报酬降低、繁殖力降低等多样致病特征[1-3]。世界范围内，奶牛M.wenyonii的感染较为普遍。Ybanez等[4]对菲律宾某规模化场的40头奶牛进行M.wenyonii检测，发现感染率为80.0%(32/40)。在我国，闫振贵等[5]对鲁西南地区规模化场的奶牛进行调查，发现不同调查点奶牛M.wenyonii感染率为50.5%(53/105)～64.3%(90/140)。加强对奶牛M.wenyonii的检查和监测有助于保障奶牛业的健康发展。

M.wenyonii主要寄生于牛红细胞表面，无细胞壁、无明显细胞核和细胞器，根据形态结构特征和分子生物学数据，将其归为支原体[6-7]。在临床生产中，常采用血液涂片镜检法检查M.wenyonii，然而该病原体与经蜱传播的寄生于红细胞内的梨形虫(Piroplasma)和无浆体(Anaplasmaspp.)等其他病原体形态相近，缺乏明显的鉴别特征，需要经验十分丰富的研究人员才能予以鉴别；同时此类经媒介昆虫传播的病原体常常存在混合感染，如近年在波黑地区的调查显示，牛同时感染M.wenyonii和分歧巴贝斯虫(Babesiadivergens)，显微镜观察很难区分；故而常规依靠显微镜观察不能准确鉴定上述病原体[8-9]。此外，受到细胞变形、异染颗粒等因素干扰，有些报道将此类非病理性形态变化的细胞也鉴定为M.wenyonii，造成较高的假阳性率[9]。基于分子生物学方法的检测，可有效鉴别M.wenyonii和其他形态相近的病原体，并可进行序列和种系发育分析，更适于开展流行病学调查研究[2,4]。

目前，有关新疆阿克苏地区奶牛温氏支原体病的流行情况调查报道尚较少，为了解新疆阿克苏地区某场奶牛M.wenyonii感染情况，采用血液涂片镜检法和PCR法对该场奶牛血液样本进行检测，以期为新疆地区奶牛温氏支原体病的诊断提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 血液基因组DNA提取试剂盒，上海莱枫生物科技有限公司产品；2×EasyTaqPCR SuperMix(+dye)，北京全式金生物技术有限公司产品。

1.1.2 主要仪器 CX31RTSF型光学显微镜，Olympus公司产品；Sorvall Legend Micro 17型微量离心机，Thermo Scientific公司产品；MC proS型梯度PCR仪，Eppendorf公司产品；DYY-7C型稳压稳流电泳仪、JY系列电泳槽，北京六一生物科技有限公司产品；Gel Doc XR+型凝胶成像系统，Bio-Rad公司产品。

1.2 方法

1.2.1 血样采集 2019年7月，随机选取新疆阿克苏地区某场1岁～2岁临床健康的奶牛12头，采用5 mL的EDTA抗凝管经颈静脉采集其血液样本，依次编号为1号～12号，现场制作血液涂片，自然干燥后滴加1滴～2滴无水甲醇；已编号的血液样本置装有冰袋的泡沫箱中保存，带回实验室置4℃保存，72 h内提取全基因组DNA。

1.2.2 显微镜观察 12份牛血液涂片经瑞氏染液染色后，置于普通光学显微镜油镜下进行观察，若观察到红细胞表面附着点状、逗点状蓝紫色颗粒，或红细胞呈棘形或星芒状，则判断为疑似M.wenyonii阳性或其他病原体阳性。

1.2.3 DNA提取 12份牛抗凝血液样本每份用移液枪吸取200 μL，按照血液基因组DNA提取试剂盒的说明书操作步骤提取100 μL全基因组DNA，置-20℃冰箱中保存。

1.2.4 PCR检测 参照文献[7]设计M.wenyoniiSSU rRNA基因特异性引物进行套式PCR检测，两轮反应程序均为94℃ 5 min；94℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 1 min，35个循环；72℃ 10 min。为进一步对M.wenyonii进行鉴别诊断，参照文献[8]设计梨形虫SSU rRNA基因通用引物进行PCR检测，反应程序为94℃ 5 min；94℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 1 min，35个循环；72℃ 10 min。参照文献[9]设计无浆体SSU rRNA基因通用引物进行PCR检测，反应程序为94℃ 5 min；94℃ 1 min，55℃ 30 s，72℃ 30 s，35个循环；72℃ 10 min。引物序列和目的片段见表1，引物由苏州金维智生物科技有限公司合成。

表1 引物序列和目的片段

PCR反应体系均为25 μL：2×EasyTaqPCR SuperMix(+dye)12.5 μL，20 μmol/L的上、下游引物各0.3 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 10.9 μL。每次PCR扩增过程中均设阳性对照样本和阴性对照样本(同等体积双蒸水)。阳性对照样本分别为牛的M.wenyonii、牛的环形泰勒虫(Theileriaannulata)和绵羊的牛无浆体(Anaplasmabovis)，由塔里木大学兽医寄生虫学实验室鉴定保存。扩增结束后，取5 μL PCR产物于10 g/L琼脂糖凝胶中进行电泳。

1.2.5M.wenyoniiSSU rRNA基因序列分析 扩增出的M.wenyonii阳性PCR产物进行直接测序，送苏州金维智生物科技有限公司进行双向测序。对成功获得的序列，NCBI数据库中进行同源性搜索，应用Clustal X 2.11软件对所获得的序列进行比对分析，鉴定M.wenyonii。在NCBI数据库中下载嗜血支原体常见种类的序列，采用Mega 7.0软件，选择最大似然法(Maximum likelihood，ML)中General Time Reversible模型，构建种系发育进化树，评价M.wenyonii遗传进化关系；发育进化树可靠性用Bootstrap分析检测，进行1 000个重复。

2 结果

2.1 显微镜下观察结果

12份血液涂片经瑞氏染色后，镜检发现有1份样本中部分红细胞表面有明显点状和不规则状紫色病原体(图1)，初步鉴定疑似为M.wenyonii；其他11份样本中未见红细胞存在明显的形态异常。

图1 血液样本经瑞氏染色后的镜检结果(1 000×)

2.2 PCR检测结果

分别基于M.wenyoniiSSU rRNA基因位点、梨形虫SSU rRNA基因位点和无浆体SSU rRNA基因位点，对12份奶牛血液DNA样本进行PCR扩增。12份样本中，有3份样品扩增出M.wenyonii目的片段(图2)，阳性率为25.0%(3/12)，其中，镜检呈病原体阳性的1份样本扩增出M.wenyonii目的片段；未扩增出梨形虫和无浆体的目的片段。

2.3 M.wenyonii SSU rRNA基因序列分析

对3个M.wenyonii阳性样本的序列进行比对，3条序列无核苷酸差异，序列一致；在NCBI数据库中进行同源序列搜索，均与NCBI数据库中M.wenyonii分离株序列(序列登录号：FJ375309和MF666879)的同源性为100%，鉴定本研究中检测到的病原体为M.wenyonii。构建种系发育进化树，分析结果显示，本研究中的3条M.wenyonii序列与我国牛的M.wenyonii分离株(FJ375309、AY769937、EF221880)、墨西哥牛的M.wenyonii分离株(KX171205)、澳大利亚牛的M.wenyonii分离株(KY412804)和日本牛的M.wenyonii分离株(EU367963)等处于同一个进化分支上，而与猪嗜血支原体(Mycoplasmasuis)、猫嗜血支原体(Mycoplasmahaemofelis)和犬嗜血支原体(Mycoplasmahaemocanis)等其他种类的嗜血支原体处于不同分支上(图3)。

采用最大似然法法构建系统发育树，节点数字分别表示自展值;黑色三角形代表本研究获得的序列

3 讨论

近年来，牛的嗜血支原体病在我国广泛流行，常用的检测方法主要是染色镜检法和PCR法。基层养殖业的技术工作人员多采用染色镜检法检测和诊断牛的嗜血支原体病，以出现变形红细胞、棘形红细胞和六芒星状红细胞为主要的判定阳性依据[5,12]，但引起红细胞变形的因素比较多，如溶血、染色液的选择、染色颗粒、血涂片厚度等，造成较高的假阳性；同时，M.wenyonii不易与其他血液类病原如梨形虫、无浆体等进行形态学鉴别[13]。本研究结合染色镜检法和分子生物学方法，对新疆阿克苏地区某场奶牛进行M.wenyonii检测，发现PCR敏感性和特异性均较好，可避免主观判断因素影响，也可与其他病原体进行鉴别诊断和混合感染诊断，准确性高。因此，在开展牛嗜血支原体病流行病学调查时，应在染色镜检法检测的基础上，进一步开展分子生物学方法检测和序列分析，以准确鉴定牛的M.wenyonii。

本次调查发现，新疆阿克苏地区某奶牛场存在M.wenyonii感染，PCR法检测阳性率为25.0%(3/12)。在我国鲁西南地区的调查显示，奶牛M.wenyonii感染较为普遍，PCR法检测不同采样点奶牛场的M.wenyonii阳性率均在50%以上，多数为隐性感染[3]。在重庆的调查显示，PCR法检测牛M.wenyonii的阳性率为11.1%(34/307)[13]。我国不同地区牛的感染情况存在一定差异，可能与地理环境、养殖条件、媒介种类等因素存在密切关系。本研究中，采集的血液样本数量较少，进一步的研究将深入开展新疆不同地区、不同季节和不同养殖条件下牛M.wenyonii的感染情况调查。

目前，尚无特效药物可治疗牛的温氏支原体病。贝尼尔(血虫净)、尼可苏、头孢多烯、多西环素和磺胺嘧啶钠等药物对牛温氏支原体病具有一定的治疗效果，应在发病初期使用，同时配合使用常规抗菌药物，防止其他细菌继发感染[9,14]。奶牛温氏支原体病感染途径尚不明确，一般认为是经吸血昆虫和注射器针头等器具进行机械传播，且与饲养条件、免疫状况和营养缺乏等因素有关，防控该病应加强饲养管理和消毒，注意环境和器具卫生，在吸血昆虫活跃的季节进行灭杀，采用贝尼尔等药物进行预防性用药。