响应面优化沙棘果多糖提取工艺 ①

李洪超,赵宏博,赵 宏,沈 宇

(1. 佳木斯大学药学院，黑龙江 佳木斯 154007；2. 佳木斯大学康复医学院，黑龙江 佳木斯 154007)

沙棘(Hippophae rhamnoides L.)又名醋柳果，酸刺果，隶属胡颓子科沙棘属，落叶灌木或乔木[1]。沙棘的根、茎、叶、花，特别是果实中含有丰富的营养成分和生物活性物质，其维生素C的含量远远高于鲜枣和猕猴桃，从而被誉为天然维生素的宝库[2]。沙棘果多糖是从沙棘果中提取的水溶性多糖。近年来，经过我国专家研究，沙棘多糖的药用价值不断被发现，引起越来越多的人对沙棘果进行研究探索。

超声辅助提取法是应用超声波强化提取植物多糖的方法，是一种物理破碎过程[3]。与常规提取法相比，超声波提取可缩短提取时间，提高提取率，所以超声提取在植物多糖的提取中得到广泛应用。本研究选取沙棘果为原材料，采用超声波辅助法提取沙棘果多糖。采用响应面分析法，在单因素试验的基础上，根据Box-Behnken中心组合实验设计原理对提取工艺条件进行优化[4～7]。为沙棘果多糖的研究及应用提供一定得理论依据及实验数据。

1 材料与仪器

哈尔滨裕嘉源农业有限公司提供新鲜的沙棘果，DPPH(美国Sigma公司)，95%乙醇(山东利尔康消毒科技股份有限公司)，葡萄糖标准品(天津市科密欧化学试剂有限公司)，维生素C(天津市科密欧化学试剂有限公司)，浓硫酸(天津市科密欧化学试剂有限公司)，苯酚(天津市科密欧化学试剂有限公司)，三氯乙酸(上海研生实业有限公司)。

FA2004N型电子分析天平(上海恒平科学仪器有限公司)，757型紫外可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)，中空纤维膜(湖州科滤膜技术有限公司)。

2 方法

2.1 沙棘果多糖的提取

准确称取沙棘果干粉1000g，按照固液比1:5，加入5000mL石油醚，设定回流温度为70℃，回流时间为2h，进行石油醚回流脱脂。加入30L蒸馏水，在提取温度60℃、提取功率100W的条件下进行超声提取45min。将提取液用8层纱布趁热过滤，滤液进行浓缩，冷却至室温后，加入95%乙醇，调乙醇浓度为80%以上，用保鲜膜封口后，置于室温中醇沉24h。用离心机3000r/min将醇沉液离心15min，取下层沉淀，置于阴凉处干燥后得沙棘果多糖粗产品。

2.2 沙棘果多糖含量的测定

2.2.1 标准曲线的制定

取浓度为0.1mg/mL的标准葡萄糖溶液，分别吸取葡萄糖标准溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，分别补水至2.0mL，以蒸馏水作为空白对照组，分别加入5%的苯酚1mL，浓硫酸5mL，摇匀，在室温下静置10min，置于40℃水浴中保温15min后冷却至室温。用紫外可见分光光度计测定波长在490 nm处的吸光度，绘制标准曲线。得回归方程：y=0.8913x+0.0102，R2=0.9994，其中x为多糖质量浓度，y为吸光度。

2.2.2 多糖含量的测定

精密称取干燥多糖样品10mg，定容至100mL容量瓶中，吸取2mL，按照2.2.1中所述的方法进行操作，平行3次实验取平均值。

多糖含量(%)=

第二，马克思主义是革命的理论。列宁指出：“马克思认为他的理论的全部价值在于这个理论‘按其本质来说，它是批判的和革命的’。后一性质的确完全地和无条件地是马克思主义所固有的，因为这个理论公开认为自己的任务就是揭露现代社会的一切对抗和剥削形式，考察它们的演变，证明它们的暂时性和转变为另一种形式的必然性，因而也就帮助无产阶级尽可能迅速地、尽可能容易地消灭任何剥削。”[1]82-83以往的一切所谓“科学”都在为人剥削人的制度进行辩护，只有马克思主义对这种人剥削人的制度进行了无情的批判，毫不掩饰自己的阶级性，公开宣布它就是要代表无产阶级利益，为无产阶级的革命运动服务。

2.3 沙棘果多糖提取的单因素试验

取干燥沙棘果实，粉碎，浸泡过夜，按照表1所设定的条件，分别进行单因素试验考察。

表1 超声提取法提取条件因素水平

2.4 响应面法优化多糖的提取工艺

在单因素试验基础上，采用Box-Behnken响应面设计对沙棘果总多糖提取条件进行优化[8～12]。以四因素三水平的响应面分析法确定影响沙棘果多糖提取率的水平因素编码设计，每个因素选取高、中、低三个水平，共29个试验点，响应面试验设计编码变量见表2。

表2 响应面试验设计编码变量

3 结果与分析

3.1 含量的测定结果

将沙棘果粗多糖在波长490nm处测得吸光度，根据葡萄糖标准曲线的回归方程y=0.8913x+0.0102，计算得出沙棘果粗多糖的含量为39%。

3.2 单因素试验的结果

3.2.1 料液比对多糖提取率的影响结果

考察不同料液比(1:10、1:20、1:30、1:40、1:50)对多糖提取的影响。由图1可知，多糖含量随着料液比的增大先增大后减小，当料液比为1:30时，沙棘果多糖的含量最佳，达34.15%。

3.2.2 提取时间对多糖提取率的影响结果

考察不同提取时间(15、30、45、60、75min)对多糖含量的影响。由图1可知，提取率随着提取时间的增大先增大后减小，当提取时间为45min时，沙棘果多糖的提取率最高，达3.919%；由图1可知，多糖含量随着提取时间的增加先增大后减小，当提取时间为45min时，沙棘果多糖的含量最佳，达34.65%。

图1 料液比、提取时间、提取功率、提取温度对沙棘果多糖提取含量的影响

考察不同提取功率(60、70、80、90、100W)对多糖含量的影响。由图1可知，多糖含量随着提取功率的增大而增大，当提取功率为100 W时，沙棘果多糖的含量最佳，达34.90%。

3.2.4 提取温度对多糖提取率的影响结果

考察不同提取温度(40、50、60、70、80 ℃)对多糖含量的影响。由图1可知，多糖含量随着提取温度的增大先增大后减小，当提取温度为60 °C时，沙棘果多糖的含量最佳，达33.20%。

3.3 响应面法优化提取工艺结果

3.3.1 试验条件与试验结果

选取料液比、提取时间、提取功率和提取温度作为影响沙棘果多糖提取率的因素。采用Box-Behnken设计方案及结果见表3。

表3 响应面试验设计编码变量与结果

图2 响应面结果

3.3.2 响应面结果分析

根据Design-Expert 软件采用中心组合试验Box-Behnken设计方案绘制响应面3D分析图。由图2可知，曲线陡峭程度最高且极值点均落在试验考察去内，提取时间与提取功率两因素对响应值影响显著。

3.4 沙棘果多糖提取工艺的优化和验证

根据Box-Behnken设计方案的计算结果，确定最佳工艺条件为：提取时间45.29 min，提取温度61.48℃，提取功率90 W，料液比1:30.88，沙棘果多糖的提取率预测值为4.023%。考虑到实际操作的便利，确定沙棘果多糖的提取率的最佳工艺参数为提取时间46min，提取温度62℃，提取功率90W，料液比1:31。对响应面法优化的沙棘果多糖的最佳提取工艺进行5次重复验证试验，提取率分别为3.994%、3.996%、3.987%、3.998% 和4.000%。沙棘果多糖的平均提取率为3.995%与模型得出的理论提取率4.023% 接近，表明响应面分析优化沙棘果多糖的提取工艺条件稳定可行。

4 讨论

本文采用超声波辅助法提取沙棘果多糖，在单因素试验优的基础上，利用Design-Expert软件，采用Box-Behnken建立沙棘果多糖提取模型。对响应面分析法优化的沙棘果多糖的最佳提取工艺进行5次重复验证试验，平均提取率与理论提取率接近，表明响应面分析法稳定可行。用响应面分析法优化沙棘果多糖的提取工艺参数具有可行性、可靠性，优选得到的最佳工艺条件稳定。有进一步研究和开发的必要。