基于网络药理学和分子对接探讨黄芪治疗糖尿病周围血管疾病的分子机制*

严仕梦，闫少庆，杨晓，王丽翔，柳国斌

上海中医药大学附属曙光医院，上海 200021

糖尿病周围血管疾病(diabetic peripheral vascular disease，DPVD)是糖尿病患者在长期病程中发生的以下肢为主的外周大、中、小动脉血管粥样病变为主的慢性并发症，临床表现为下肢皮肤干燥，肢体感觉发凉麻木、酸胀感、出现静息痛、间歇性跛行等临床症状，病程后期可出现干性坏疽[1]。糖尿病患者受高血糖影响，出现一系列血管硬化、增厚、弹性下降等周围血管病变，是患者非外伤致残的主要原因之一[2]。目前治疗糖尿病周围神经血管病变主要从控制血糖、改善微循环等方面入手，但总体疗效欠佳。在治疗DPVD方面，中西医结合治疗效果更佳，且不良反应少[3]。中医学认为本病以虚为本，瘀为标，通过对DPVD中医用药规律进行聚类分析，发现其中黄芪在补气治疗应用中占据首位，黄芪是中医学治疗DPVD的关键组分[4]。

黄芪，多年生草本植物，为豆科植物蒙古黄芪的干燥根，药用历史悠久，最早记载于《神农本草经》，具有固表止汗、生津养血等功效[5]。古代常称黄芪为“黄耆”，指的就是黄芪为补气之长，补气之要药。现代研究表明，黄芪能够增强免疫功能，增强机体耐缺氧能力和应急能力，促进机体代谢等功能[6]。网络药理学是近年来新兴的一种强大药物作用分析工具，将药物网络与生物结合，为药物疗效的深入机制分析提供证据，在研究中医药疗效方面发挥着重要作用，为传统中药在分子微观水平探讨多重药理机制提供了诸多可能[7]。分子对接Autodock Vina 采用的是半柔性对接的方式，受体为刚性，只改变小分子配体，根据拉马克遗传算法在格点盒子中依次计算格点能，寻找结合能最低的结构象，具有花费时间少、效率高、精度佳的特点。目前黄芪治疗DPVD的研究仍较少，机制研究匮乏。本研究基于网络药理学和分子对接探索黄芪治疗DPVD的有效成分和作用靶点，筛选关键组分，为研究黄芪治疗DPVD进一步研究和应用提供依据。

1 资料与方法

1.1 筛选黄芪的有效化学成分和治疗疾病靶点通过TCMSP数据库检索药物黄芪，得到成分87个。通过口服生物利用度(OB)≥30%，药物相似性(DL)≥0.18对有效成分进行筛选[8]，得到黄芪有效成分20个。利用TCMSP数据库搜寻黄芪有效化学成分中的每个靶点的信息，通过Perl数据包结合Uniprot数据库(https：//www.uniprot.org/)对得到的药物靶点进行规范。以关键词 “Diabetic Peripheral Vascular Disease”在GeneCards、OMIM数据库筛选疾病靶点基因并进行合并去除重复值，然后对规范化后的药物靶点基因和GeneCards、OMIM中筛选得到的疾病靶点基因取交集，得到药物-靶点基因韦恩图。

1.2 疾病-药物-主要成分-靶点网络可视化将黄芪-DPVD的共同靶点基因和黄芪治疗疾病主要成分相关靶点信息导入Cytoscape (3.7.2)进行处理，顺序导入疾病、药物分子网络信息和节点类型，呈现疾病-药物-关键化学分子-疾病靶点可视化网络。

1.3 蛋白质互作网络构建和核心作用靶点筛选进入String数据库构建蛋白质互作网络(protein protein interaction network，PPI)，选择人源物种，导入黄芪-DPVD的交集基因，得到蛋白互作网络，将蛋白关系评分设为高级别0.7，隐藏游离蛋白，黄色连线表示文本挖掘证据，蓝色连线表示基因共进化证据，红色连线表示基因融合证据等，下载PNG格式PPI蛋白互作图，保存PPI互作TSV文件，导入Cytoscape，运用MCODE插件分析核心作用靶点。

1.4 GO和KEGG富集分析通过Perl语言数据包转换交集基因名称为基因ID。安装R语言数据包，设置pvalue<0.05，qvalue<0.05对基因ID进行GO和KEGG富集分析，输出结果绘制barplot柱状图[9]。

1.5 分子对接验证在TCMSP网站下载黄芪治疗DPVD主要药物成分的mol2结构式，运用AutoDock tools(1.5.6)进行处理，通过加氢，计算电荷数目，合并非极性氢后保存为pdbqt格式。从RCSB PDB数据库(https：//www.rcsb.org/)下载PDB格式的核心靶点蛋白结构，运用AutoDock tools(1.5.6)进行同样的处理，根据每个受体蛋白结构的不同，定义不同的Grid Box盒子。运用Autodock Vina(1.1.2)进行药物配体和靶点蛋白的对接，选取每个药物配体结合能最低的结合能。计算黄芪主要成分中每个成分与10个核心靶点的平均结合能，取绝对值，绘制平均结合能绝对值条形图，将得到的受体配体复合体导入Discovery Studio (3.5)客户端转换pdb格式，然后导入Pymol 软件(1.7)，导出图片格式。

2 结果

2.1 黄芪有效成分筛选通过查询TCMSP平台获得黄芪成分列表，经过生物利用度OB，药物相似性DL筛选出20种有效成分。

2.2 预测药物-疾病靶点通过TCMSP数据库逐个查询黄芪有效成分，汇总所有靶点，运用Perl语言包进行基因名称注释标准化。在GeneCards和OMIM数据库中搜索DPVD的靶基因，共获得靶点 7 469 个。通过R包对黄芪靶点和DPVD的靶点绘制韦恩图(见图1)，筛选出98个交集靶点，可能是黄芪治疗DPVD的潜在作用靶点。

图1 黄芪与DPVD靶点交集韦恩图

2.3 疾病-药物-关键药物分子-靶点网络构建通过Cytoscape 软件对疾病-药物-关键药物分子-靶点可视化处理，记录疾病药物共同靶点所对应的化合物，最终得到黄芪-DPVD的关键化学成分16个，见表1。根据节点属性及网络关系，构建网络可视化图，见图2。

表1 黄芪作用DPVD主要成分

图2 黄芪与DPVD网络可视化图

2.4 蛋白质互作核心网络构建将98个共同靶点基因导入String数据库，绘制蛋白互作网络分析图，见图3。其中评分≥0.997的互作蛋白为VEGFA-KDR、NOCOA2-AR、MAPK8-JUN、KDR-VEGFA、F7-F3、EGRF-EGF、PPARG-NCOA2、PPARG NCOA1、RXRA-PPARG、NCOA2-RXRA、NCOA1-ESR1、NCOA1-RXRA。这些蛋白在PPI网络中起着重要作用，可信度高。将TSV文件导入Cytoscape，运用MCODE插件分析核心基因，分别为EGF、CCL2、VEGFA、MAPK8、IL-6、PPARG、JUN、MMP2、MMP1、IL-1B，见图4。

图3 黄芪靶标蛋白质互作网络图

图4 核心基因网络图

2.5 GO和KEGG富集分析结果通过富集分析，筛选出前20条GO生物学过程，排名靠前的生物学过程包括肽结合活性，酰胺结合活性，丝氨酸水解酶活性，内肽酶活性，G蛋白偶联胺受体活性，神经递质受体活性，丝氨酸型内肽酶活性，丝氨酸型肽酶活性，核受体活性转录因子活性，直接配体调节的序列特异性DNA结合氧化还原酶活性等，见图5。通过富集分析，筛选前20条KEGG相关信号通路，包括流体剪切力与动脉粥样硬化通路，糖尿病并发症糖基化及糖基化受体信号通路，IL-17信号通路，TH17细胞分化通路，雌激素信号通路，TNF信号通路，内分泌抵抗通路，表皮生长因子酪氨酸激酶抑制抵抗信号通路等，见图6。黄芪可以通过众多生物学调控发挥治疗DPVD的作用。

图5 黄芪靶标GO富集分析

图6 黄芪靶标KEGG富集分析

2.6 分子对接验证通过运用AutoDock Vina对核心靶点基因和黄芪主要成分依次对接，计算每个基因和黄芪每个成分的最低结合能，运用R包绘制黄芪成分与核心靶点的热图，见图7。分子对接中，结合能的绝对值越大，则化合物越能与靶点更好地结合，产生稳定的构象。当结合能>5.0时，提示化合物与靶点有较好的结合活性，结合能>7.0时，具有强烈的结合活性[10]。黄芪主要成分与核心靶点大部分能产生较好的结合能，部分结合能达到了-10 kJ·mol-1，其中黄芪异黄烷苷(MOL000379)、白桦脂酸(MOL000211)、叶酸(MOL000433)平均结合能均>7，提示与核心靶点有较好的结合能，见图8。选取3种成分与靶点最高结合能进行卡通结构呈现，黄芪异黄烷苷与JUN和VEGFA(结合能-8.8 kJ·mol-1)，白桦脂酸与VEGFA(结合能-9.1 kJ·mol-1)，叶酸与JUN(结合能-9.1 kJ·mol-1)，呈现二维结构图，见图9。

图7 黄芪主要成分与靶标的分子对接热图

图8 黄芪主要成分平均结合能绝对值图

注：A：黄芪异黄烷苷与VEGFA蛋白结合；B：黄芪异黄烷苷与JUN蛋白结合；C：白桦脂酸与VEGFA蛋白结合；D：叶酸与JUN蛋白结合图9 黄芪核心成分靶点结合卡通模式图

3 讨论

DPVD归属中医“血痹”“脱疽”范畴，属消渴并发症类，病机属气阴两虚，可兼夹湿痰等，中医药治疗DPVD具有较好的疗效[11]。“营气虚则不仁”(麻木不仁、不会感知)，“卫气虚则不用”(不能视听言动)。黄芪为补气之要药，尤擅长补营卫之气，能够补充DPVD患者中气虚之象，气旺则血行，气血充盈，周身濡养。本研究通过网络药理学方法，利用TCMSP数据库平台发现黄芪有87种成分，运用DL值和OB值筛选出20种有效成分，对应成分靶点104个，通过绘制交集韦恩图，筛选出主要成分16种，核心靶点98个，占黄芪成分靶点的94%，富集主要GO和KEGG通路20条，提示黄芪能够调控动脉硬化和血管压力、糖尿病并发症糖基化代谢、TNF、IL-17炎症调节、EGFR血管内皮生长因子通路调控等通路，介导核受体活性、G蛋白耦联受体、胆固醇激素等受体活性，在治疗DPVD中能够发挥多靶点调控效应。黄芪治疗DVPD与IL-6、JUN、MAPK1、MAPK8、VEGFA、EGF、IL-1B等基因调控密切相关，下游蛋白存在较强的相互作用，而这些蛋白多与DPVD中炎症因子、血管再生、信号凋亡通路等密切相关。研究表明，异鼠李素(MOL000354)能够改善 α-葡萄糖苷酶活性调节血糖[12]；刺芒柄花素(MOL000392)通过调节大鼠子宫、胸主动脉和乳腺组织血管内皮细胞中IGF-1R和ICAM-1的表达，进而促进内皮细胞增殖和血管生成[13]；毛蕊异黄酮(MOL000417)能够促进血管新生、抗氧化、保护内皮[14]。槲皮素(MOL000098)能够调控PI3K/Akt促进内皮祖细胞促进损伤血管内皮修复[15]。黄芪主要成分中黄芪异黄烷苷、叶酸、白桦脂酸与DPVD平均结合能均较高，能够与转录因子AP-1和血管内皮生长因子靶点在结构上发生较稳定结合，提示这3种成分可能在黄芪治疗DPVD中发挥重要作用。林辉等[16]通过采用不同剂量叶酸(MOL000433)干预冠状动脉粥样硬化性心脏病患者，临床研究发现，叶酸具有改善血管内皮功能。白桦脂酸(MOL000211)具有稳定的抗炎作用，可以影响多重炎症信号通路[17]。而目前黄芪异黄烷苷的研究较少，但通过网络药理学推测其可能为黄芪治疗DPVD的核心成分之一，在今后研究中可以进一步对其进行挖掘研究。

本文从网络药理学角度出发，探讨了黄芪治疗DPVD中可能存在的内在机制，发现黄芪主要成分可能对DPVD发挥多靶点调控作用，并通过分子对接发现黄芪主要成分均能与DPVD核心靶点有较好的稳定结合，提示黄芪可能在治疗DPVD中发挥重要作用，为临床诊疗及DPVD分子机制研究提供一定的参考。