EB病毒血清免疫球蛋白A检测在鼻咽癌筛查中的应用△

龚一帆 唐冰花 宋新貌 汤荔 王朱健 曹文俊

（1.复旦大学附属眼耳鼻喉科医院检验科 上海 200031；2.复旦大学附属眼耳鼻喉科医院放疗科 上海 200031）

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）是源于鼻咽部上皮组织的一种头颈部恶性肿瘤，大部分患者发现时已为晚期，预后较差。全世界约80%的NPC 患者在中国，早期诊断、早期治疗是提高NPC患者生存率及降低死亡率的重要手段。然而NPC早期症状隐匿，容易被误诊、漏诊[1]。大量研究表明，EB 病毒感染及其导致的一系列表观遗传学改变与NPC 发病有着密切关系[2-3]，联合多项EB 病毒抗体检测对NPC 的诊断有临床意义[4-6]；然而各方报道在项目组合及结果解读上仍存在争议，并缺少大样本、多中心的临床研究。本研究通过酶联免疫 吸 附 测 定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）检测662 例初诊NPC 患者和731 例健康成人血清中EB 病毒的免疫球蛋白A（immunoglobulin A,IgA）抗体，包括Z 反式激活因子（Z trans activator,Zta）/IgA、EB 病毒核抗原1（EB virus nuclear antigen 1,EBNA1）/IgA、衣壳抗原（viral capsid antigen,VCA）/IgA，总结并分析EB 病毒IgA 不同结果模式对NPC诊断的临床价值。

1 资料与方法

1.1 资料 NPC 组：2016～2019 年在我院就诊、经鼻咽活检病理确诊、未经治疗的NPC 患者662 例，年龄12～88 岁，平均53.34 岁，中位年龄为55 岁；男性471 例、女性191 例。健康对照组：同期健康体检人群731 例，其中男性475 例、女性256 例；年龄18～76 岁，平均44.27 岁，中位年龄为43 岁。临床筛查组：同期因有NPC 症状，来我院就诊排除NPC 的患者157 例，男性96 例、女性61 例；年龄12～86 岁，平均48.46 岁，中位年龄为47 岁。3组患者的性别、年龄等一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。本研究遵循《赫尔辛基宣言》的原则。本研究的设计和实施经我院伦理委员会批准，所有研究对象均已签署知情同意书。

1.2 方法 采集患者静脉血4 mL 于真空管中，30 min 凝固后以3 000 转/min 离心10 min，之后分离血清标本检测。Zta/IgA、EBNA1/IgA 抗体检测试剂盒购自中山生物有限公司，VCA/IgA 抗体检测试剂盒购自欧蒙（德国）医学实验诊断股份有限公司。均采用ELISA 检测，根据试剂说明书进行操作。酶标仪型号为Tecan（瑞士）贸易有限公司Sunrise 酶标仪。抗体水平以标本吸光度（optical density，OD）值/ Cutoff 值计算相对吸光度值表示。相对吸光度值大于诊断界值时定为阳性，低于或等于诊断界值时为阴性。

1.3 统计学处理 本研究应用GraphPad Prism 5 绘制受试者操作特征（receptor operation characteristic，ROC）曲线，MedCalc14 及软件进行t检验及卡方检验，以ROC 曲线计算出最佳诊断界值，并计算各抗体的敏感度、特异度、约登指数及曲线下面积（area under the curve,AUC）。

2 结果

NPC 患者血清中Zta/IgA、EBNA1/IgA、VCA/IgA 3种抗体的水平分别为3.344±3.422、3.674±2.746、5.676±3.889，健康人群中3 种抗体的水平分别为0.165±0.395、0.318±0.627、0.709±0.835，NPC 患者EB 病毒抗体水平均显著高于健康对照组（P值均＜0.001）。3 种抗体的ROC 曲线见图1。3 种抗体根据ROC 曲线计算出的最佳临界值，灵敏度、特异度、约登指数、AUC 及阳性预测值比较见表1。

图1 NPC患者3种抗体ROC曲线 A.Zta/IgA；B.VCA/IgA；C.NA1/IgA。

表1 NPC患者3种抗体的最佳临界值、灵敏度、特异度、约登指数及AUC比较

EB 病 毒Zta/IgA、EBNA1/IgA、VCA/IgA 3 种抗体组合的8 种不同结果模式在健康对照组、NPC组及临床筛查组中出现的比例见表2。可以看出：NPC 组出现单独1 种抗体阳性结果模式的比例显著低于健康对照组，而2 种或3 种抗体阳性的结果比例显著高于健康对照组，3 种抗体全阳的结果模式在NPC 组中出现的概率最高，可达74.77%，而健康对照组则只有6 例，全阳的结果模式有着最高的阳性预测值率，达98.82%。临床筛查组中，除单独Zta/IgA、EBNA1/IgA 及Zta/IgA+EBNA1/IgA 阳性的 结果模式，其他模式比例均高于健康对照组。

表2 各抗体结果模式在健康对照组、NPC组及临床筛查组中出现的比例[n（%）]

157 例临床筛查组的Zta/IgA、EBNA1/IgA、VCA/IgA 阳性率分别为24.84%，29.93%和40.76%，显著高于健康对照组，低于NPC 组（P＜0.0001），其中有42 例患者进行了病理活检，最终确诊17 例。42 例抗体结果为全阴的患者有12 例，无NPC 病理结果；单抗体阳性13 例，有4 例病理确诊NPC；9例双抗体阳性的患者中，有5 例病理诊断NPC；8 例 3 种抗体全阳的患者最终均经病理确诊为NPC。

3 讨论

有文献[7]报道，NPC 经放射化学治疗（简称放化疗）后，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期的5 年无复发生存率分别为95.7%、64.7%、54.5%、41.1%，认为早期诊断及对高危人群的跟踪随访是提高NPC 治愈率,获得良好预后的关键。作为诊断金标准的病理检查往往由于受病程、病变部位及采样因素的影响，而无法早期确诊。在世界卫生组织（WHO）的NPC 专著中，有研究[8]认为组合应用ELISA 血清学可辅助诊断NPC，并在国内得到证实。然而，90%以上的世界人口存在EBV 的潜伏感染[9]，造成EB 病毒抗体血清检查在NPC 的筛查中存在相当比例的假阳性及假阴性，进而引起临床医师及患者的疑虑[10]。因此，如何选择高灵敏度及特异度的抗体组合并对结果进行准确分析及判断，帮助临床更准确地评估疾病风险成为目前急需解决的问题。

EB 病毒感染宿主后，多数细胞中的DNA 病毒处于潜伏状态，并合成EBNA1，部分病毒可进入溶解感染期，最终宿主细胞裂解，病毒颗粒释放，细胞合成溶解早期蛋白Zta、溶解晚期合成VCA 等相关蛋白[11-12]，这些抗原与免疫系统反应产生相应抗体。由于IgA抗体与IgG相比具有更短的血清半衰期，因此我们分析不同人群中EB 病毒Zta/IgA、EBNA1/IgA、VCA/IgA 3 种抗体的结果模式来研究3 种抗体联合检测对于NPC 诊断的临床意义。结果显示，3种抗体均具有较好的特异度、灵敏度、约登指数、AUC 及阳性预测值，与国内采用相同方法学的研究结果一致[13-15]。我们通过大样本研究进一步证实了3 种抗体对于NPC 具有较高的诊断效能，认为3 种抗体与NPC 患者EB 病毒各感染期活跃的免疫应答密切相关，是NPC 血清学诊断的可靠指标。

3 种抗体联合检测的各种结果模式在NPC 组及健康对照组中出现的比例均存在显著差异（P值均＜0.05）。所有的单抗体阳性模式在健康对照组中出现的比例较NPC 组高，而2 种或3 种抗体阳性的结果模式则更多出现在NPC 组中，提示EB 病毒感染在NPC 患者中存在着与正常人群截然不同的免疫反应。我们发现，662 例NPC 患者中3 种抗体全阳的结果模式占74.77%，而731 例健康对照人群中仅有6 例，阳性预测值可达98.82%，即3 种抗体阳性的样本中98.82%为确诊NPC 患者。结果表2 中双抗体阳性的阳性预测值为64.29%～84.78%，单抗体阳性结果模式的阳性预测值较低，为10.81%～24.66%，而3 种抗体全阴的患病风险仅为1.42%。在临床筛查组中也有相同的表现，抗体阳性数越多，病理确诊率越高，证实联合检测3 种EB 病毒IgA 抗体，可以有效提高疾病诊断的准确性，与单独抗体检测相比具有更高的特异度、灵敏度及阳性预测值，通过结果模式的分析可以帮助临床进行风险分级，对高危人群进行跟踪随访，有助于疾病的早期诊断。

由于我们的研究只检测EB 病毒相关抗体，因此检测结果容易受到个体免疫因素或EB 病毒免疫逃避机制的影响。此外，一些病理类型的NPC 与EB 病毒关系不密切[16]，也影响了抗体检测对诊断的灵敏度。在抗体全阴性的6 例NPC 患者中有2 例病理分型为中低分化型鳞癌，1 例在治疗后随访出现抗体阳性。这是由于大部分情况下抗体早于病变出现，但是免疫逃避使得抗体出现滞后于病变，因此需要进一步研究与其他肿瘤相关标志物的联合检测来提高诊断的准确性。

EB 病毒Zta/IgA、EBNA1/IgA、VCA/IgA 3 种抗体联合检测方法简便、经济，相对于EB 病毒DNA检测更易于推广，可进行大样本的筛查，并帮助临床更好地评估疾病风险，有助于NPC 的早期诊断。