肝脏再生动物模型研究进展

李嘉兴，李明意

(1.广东医科大学，广东 湛江 524023； 2.广东医科大学附属医院肝胆外科，广东 湛江 524001)

肝脏由肝细胞、胆管上皮细胞、库普弗细胞和淋巴细胞等组成，是机体最重要的实质性器官之一，具有代谢脂类蛋白质、调节血容量和维持水电解质平衡等生理功能[1]。肝炎、脂肪肝、肝硬化和肝癌等肝脏相关疾病的发病率逐渐升高，已成为世界范围内导致患者死亡的主要原因之一。2010年，全球超过200万人死于肝脏疾病(包括急性肝炎、肝硬化和肝癌)，约占全球死亡人数的4%[2-3]。导致肝脏损伤的因素较多，包括药物性肝损伤、化学损伤、病毒性肝炎、肝硬化和肝癌等。肝脏再生潜能巨大，根据不同损伤方式和程度肝脏表现出不同的再生方式[4]。因此，有效激发正常肝细胞的再生潜能、促进肝损伤的修复、维持肝脏正常的生理功能是治疗肝脏疾病的关键。目前研究者对肝脏再生机制的认识和理解均来自实验动物，因此研究肝脏再生动物模型有助于了解肝损伤后再生的调控机制，指导临床肝脏疾病的治疗。现就肝脏再生动物模型的研究进展予以综述。

1 部分肝切除模型

1.170%肝切除模型 最经典的肝切除模型是大鼠70%肝切除模型，该模型将大鼠肝脏的左外叶和中叶切除，相当于切除大鼠70%的肝脏[5]。正常情况下，大多数肝细胞处于静止期，只有不到1%的肝细胞进入增殖期以更新衰老的肝细胞[6]，维持肝脏正常的生理功能。70%肝切除模型只切除了部分肝脏，且不会对剩余肝细胞造成任何损伤，因此是研究肝细胞正常增殖调控的良好模型。Köhler等[7]通过研究大鼠肝切除模型发现，门静脉周围肝细胞中的Notch-1和齿状蛋白1表达升高，同时Notch胞内结构域的核易位在肝切除后增加并于15 min内达峰值；而使用干扰小RNA沉默Notch-1和齿状蛋白1则可导致肝细胞增殖减少，从而减缓肝脏再生。另有研究发现，Notch信号可通过Notch胞内结构域/蛋白激酶B/缺氧诱导因子-1α通路调节肝脏再生，抑制Notch信号通路可阻碍肝细胞由S期向M期转化，从而影响肝脏再生[8]。Grijalva等[9]通过研究70%肝切除模型发现，Yes相关蛋白的活化和核定位在肝脏再生的早期即开始增加，且术后前3天增加最显著，并随着肝脏恢复到原来的体积而逐渐降至正常水平。还有研究发现，Yes相关蛋白过表达可直接促进肝细胞增殖或通过Notch-2转录调控使成熟的肝细胞去分化为肝祖细胞，从而增加肝脏体积或促进肝损伤修复[10-11]。有研究显示，Yes相关蛋白和转录共刺激因子缺失的肝切除模型突变体小鼠的肝细胞不能有效进入细胞周期，导致肝脏完全再生受阻[12]。以上研究表明，Notch和Hippo信号通路可通过激活DNA复制促进正常肝细胞增殖或去分化为肝祖细胞，参与肝部分切除后的肝脏再生。

1.2极限肝切除模型 临床上，对于巨大肝癌或肝脏肿物的患者通常采取扩大肝切除术，对肝脏进行较大范围切除。由于切除的肝脏较大，患者剩余肝脏功能储备不足，患者术后易发生急性肝衰竭。研究术后肝衰竭的病理生理机制、促进术后肝脏再生、提高术后存活率是临床肝胆外科面临的主要问题。在不同的部分肝切除术中，肝细胞均出现肥大，仅在70%肝切除和90%肝切除术中出现肝细胞增殖[13]。因此，促进行扩大肝切除术患者的肝脏再生、减少肝癌患者围手术期肝衰竭的发生，对于提高中晚期肝癌患者的预后具有重要意义。Zhai等[14]发现，CXC趋化因子受体4拮抗剂AMD3100联合小剂量免疫抑制剂FK506可诱导内源性骨髓干细胞分化，促进行扩大肝切除术后小鼠的肝脏再生，并改善其肝功能。Kim等[15]研究表明，血管升压素可显著提高90%肝切除大鼠的存活率，表明生长抑素对术后肝脏再生有一定促进作用。

1.3反复肝切除模型 反复肝切除模型由Simpson和Finckh[16]于1963年建立，吴毅平和吴在德[17]在此基础上尝试以不同的切肝量反复切除大鼠肝脏，旨在阐述反复肝切除的可行性。Saito等[18]通过建立连续两次70%肝切除大鼠模型发现，二次肝切除后肝细胞仍具有较大的再生潜能。肝脏部分切除术是肝癌治疗的首选方法，但肝癌术后5年肿瘤复发转移率仍高达40%～70%[19]。Li等[20]发现，二次手术切除肝复发肿瘤的疗效良好，术后5年存活率为54.4%，与初次手术的疗效相近。有报道称，肝切除后会出现术后粘连，从而增加术中出血量和手术时间，因此反复肝切除会增加手术的病死率[21]。Arima等[22]研究发现，接受二次肝切除与单次肝切除肝癌患者的白蛋白等生化指标比较差异无统计学意义，且两组患者的肝脏再生能力相似。此外，Wicherts等[23]通过比较1990—2010年接受手术治疗的肝结直肠癌转移患者发现，重复肝切除患者首次肝切除术后3年和5年的总生存率分别为76%和54%，而仅行一次肝切除术患者3年和5年的总生存率分别为58%和45%，表明重复肝切除可提高复发性肝癌患者的生存率。以上研究表明，复发性肝癌患者仍可从二次肝部分切除术中受益。一项回顾性分析研究显示，重复肝切除与单次肝切除患者在肝功能不全、胆漏和瘘管方面具有可比性，两组病死率和总病死率比较差异无统计学意义[24]。由于肝源短缺，临床挽救性肝移植治疗复发性肝癌存在局限性，而二次肝切除术可作为复发性肝癌的重要治疗手段。

2 门静脉结扎模型

家兔门静脉结扎实验表明，将部分门静脉分支结扎后，家兔肝叶出现萎缩，而未结扎的肝叶则出现代偿性增生肥大[25]。有研究通过比较80%门静脉结扎大鼠模型和80%肝切除大鼠模型发现，细胞周期蛋白D1对两种不同模型的肝细胞增殖均具有重要作用，而80%门静脉结扎大鼠模型的存活率更高[26]。因此，门静脉结扎模型作为肝脏再生动物模型，具有更方便、稳定、可靠等特点。Lauber等[27]将大鼠分为3组，分别行70%、80%和90%门静脉结扎，结果发现，不同程度的门静脉结扎后门静脉压均相应升高；同时还发现，90%门静脉结扎模型未结扎肝叶大鼠的有丝分裂肝细胞增加，且其有丝分裂细胞计数更早达到峰值，同时有丝分裂细胞数目显著高于70%门静脉结扎模型和80%门静脉结扎模型大鼠。自噬是指细胞受到自噬信号诱导后在胞质中形成自噬泡将待降解物包裹，并与溶酶体融合形成自噬溶酶体，从而将包裹的物质降解的过程。研究发现，门静脉结扎模型大鼠的自噬被激活，且自噬活性微管相关蛋白轻链3Ⅱ/Ⅰ与Beclin1和细胞周期蛋白D1水平均呈正相关[28]。门静脉栓塞或结扎是临床治疗肝癌的手段之一。对于需要行肝癌扩大根治术的患者，由于切除的肝脏体积较大，且患者常伴有肝炎、肝硬化等肝脏疾病，导致术后剩余肝脏功能储备不足以维持人体正常生理活动，引起肝衰竭甚至死亡，因此限制了肝切除术的应用。有报道称，在肝癌扩大切除术前行门静脉结扎术，可增加剩余肝脏的体积，提高手术的安全性，减少术后并发症的发生[29]。联合肝脏离断和门静脉结扎的分阶段肝切除术最早用于肝门部胆管癌的治疗[25]。Schnitzbauer等[30]分析行联合肝脏离断和门静脉结扎的分阶段肝切除术的肝癌患者的临床资料发现，术后5～28 d(中位时间9 d)残余肝脏体积迅速增生，且残余肝脏体积的中位增长率达74%。不同程度门静脉结扎可诱发不同强度的肝脏再生反应，且自噬参与这一过程。肝部分切除术是治疗肝癌的首选方法，但对于不适宜立即行肝部分切除术的患者，可以先行门静脉结扎术，诱导肝脏再生，提高肝部分切除术耐受性，减少术后并发症的发生。门静脉结扎模型的建立及研究可为肝癌患者提供更多的治疗选择。

3 化学损伤模型

肝脏再生是一个病理生理过程，临床上许多肝病患者均存在不同程度的肝损伤。四氯化碳(CCl4)、D-半乳糖胺(D-galactosamine，D-GaIN)、酒精、硫代乙酰胺等均具有肝毒性，长期过量应用可导致肝脏损害、肝实质细胞死亡，从而引起肝细胞再生。构建化学药物肝损伤再生模型，模拟肝脏的再生过程，对研究肝脏不同性质病变的再生调控机制、指导临床肝脏疾病诊治均具有重要意义。

3.1CCl4损伤模型 CCl4是建立化学药物肝损伤动物模型最常用的药物之一，主要机制是CCl4进入机体后，经过肝脏代谢产生三氯甲基和氧自由基，这些自由基与肝细胞及线粒体膜上的磷脂分子共价结合，从而引发脂质过氧化，导致膜的结构和功能破坏[31]。此外，自由基还可抑制细胞膜和线粒体膜钙泵的活性，导致大量钙离子内流，进而导致肝细胞坏死[32]。Foroutan等[33]通过单次腹腔注射CCl4构建大鼠急性肝损伤模型，结果发现，大鼠天冬氨酸转氨酶、丙氨酸转氨酶和碱性磷酸酶水平均升高，肝细胞凋亡和炎症增加。花生四烯酸信号转导通路是炎症过程的重要组成部分，有研究报道，在大鼠急性肝损伤模型中，CCl4可诱导花生四烯酸参与的c-Jun氨基端激酶/胞质磷脂酶-2/12-脂肪氧化酶炎症信号通路的激活，从而导致肝细胞炎症的发生[34]。朱安妮等[35]分别通过单次腹腔注射0.1%、0.2%和0.3%的CCl4建立小鼠急性肝损伤模型，结果发现，CCl4造成的急性肝损伤呈剂量依赖性；进一步分析血浆转氨酶水平变化发现，0.1% CCl4是建立小鼠急性轻度肝损伤模型的适宜浓度，有利于肝脏再生药物的研究。长期持续存在的肝损伤会导致肝脏发生纤维化，而肝星状细胞的活化是肝纤维化的重要环节。Duan等[36]在CCl4致大鼠肝纤维化模型中发现，Notch通过激活内皮型一氧化氮合酶/可溶性鸟苷酸环化酶信号通路导致肝窦内皮细胞去分化和肝纤维化，从而影响肝细胞增殖和肝脏再生。Delta样配体4(Delta-like ligand 4，DLL4)是Notch信号通路的配体，主要在内皮细胞中表达并维持肝窦稳态。Chen等[37]发现，在人和CCl4诱导的鼠纤维化肝脏的肝窦内皮细胞中DLL4表达上调，这与肝窦内皮细胞的毛细血管化和肝纤维化一致，而体内沉默DLL4则可减轻肝窦内皮细胞毛细血管化和CCl4诱导的肝纤维化。CCl4损伤模型是常用的药物性肝损伤模型，可用于急性肝损伤甚至肝脏纤维化的研究，该模型可准确反映肝脏的结构、功能和代谢变化，是研究肝损伤病理机制和筛选护肝药物的经典模型。

3.2D-GaIN损伤模型D-GaIN是常见的引起肝损伤的肝毒性药物[38]。D-GaIN造成肝损伤的主要机制是D-GaIN进入肝细胞后与葡萄糖焦磷酸化酶结合，阻碍糖原合成，导致肝细胞的功能和结构受损，甚至引起肝细胞坏死[39]。此外，D-GaIN还可通过增加氧化应激，产生活性氧类，引起线粒体功能障碍，破坏细胞的结构和功能，导致肝细胞凋亡[32]。Yu等[40]发现，成纤维细胞生长因子21可通过激活核因子红系2相关因子2触发磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B信号通路，减轻D-GaIN诱导的氧化应激对小鼠肝脏造成的损伤，促进肝脏再生。Wang等[41]发现，山楂酸可抑制脂多糖/D-GaIN诱导的急性肝损伤模型小鼠血清和肝组织中炎症细胞因子肿瘤坏死因子-α和白细胞介素6-水平升高，上调肝组织中丙二醛和髓过氧化物酶活性；此外，山楂酸还可下调核因子κB的表达，上调核因子红系2相关因子2和血红素加氧酶1的表达。表明山楂酸通过抑制核因子κB和核因子红系2相关因子2信号通路激活，保护脂多糖/D-GaIN诱导的肝损伤。有研究发现，乳杆菌R005通过下调肝脏和肠道中的Toll样受体、肿瘤坏死因子-α和核因子κB转录，降低促炎细胞因子的血浆浓度而表现出抗炎特性，可在一定程度上缓解D-GaIN造成的急性肝损伤[42]。总之，D-GaIN所致的肝脏损伤的病理变化与病毒性肝炎相近，故D-GaIN损伤模型是研究病毒性肝炎较理想的动物模型。

3.3酒精性肝损伤模型 酒精性肝病是临床肝胆外科常见的一类疾病，可诱发肝脂肪变性、肝进行性纤维化、肝硬化甚至肝癌。因乙醇消费导致的死亡约占全球总死亡人数的3.8%[43]。人体摄入乙醇后，首先在肝脏中通过乙醇脱氢酶系统、乙醇氧化酶系统和过氧化氢酶系统氧化代谢为乙醛，然后再进一步转化为乙酸。乙醛代谢过程中的氧化应激和脂质过氧化产生大量活性氧类，可造成肝细胞线粒体损伤或诱导肝细胞凋亡，是导致酒精性肝病的主要原因。Lieber-DeCarli模型是目前研究慢性肝损伤应用最广泛的动物模型，该模型在液体饮食中添加高浓度的酒精，连续喂养大鼠4～12周，模拟人类肝脏慢性酒精中毒的病理改变[44]。Bertola等[45]通过Lieber-DeCarli流质饮食4～6周以及在喂养期间多次单剂量酒精(5 g/kg)灌胃喂养小鼠，模拟临床上有长期慢性饮酒史的患者暴饮暴食后诱发的急性肝损伤，结果发现，与Lieber-DeCarli模型相比，慢性和暴饮暴食酒精除可导致小鼠血清丙氨酸转氨酶和天冬氨酸转氨酶升高外，还可导致肝脏广泛脂肪变性。有学者在酒精流质饮食喂养小鼠4周的基础上，再通过腹腔向小鼠体内注射CCl4(每周2次，持续4周)，利用CCl4对肝细胞的损伤作用诱发肝脏炎症和肝纤维化[46]。理想的酒精性肝损伤模型对于研究和阐明酒精性肝损伤的病理机制以及促进酒精性肝病的防治均具有重要意义。

4 小 结

不同类型的肝脏损伤应采用不同的造模方法。良好的动物模型可通过完整模拟疾病的发病特点、组织损伤和病理变化，为疾病病理机制的研究、诊治以及药物的研发等提供坚实的基础。肝脏损伤导致的肝脏疾病是影响人类健康的常见疾病。引起肝脏损伤的因素主要包括化学性、药物性、酒精性及环境因素等，长期肝脏损伤可诱发肝炎、脂肪肝、肝硬化甚至肝癌等疾病。因此，应用不同的造模方式模拟不同肝脏疾病的病理特点，有助于促进肝脏再生的研究，也可为相关肝损伤治疗药物及治疗方法的研究提供实验基础和理论依据。