抗M3R抗体在干燥综合征发病机制及治疗中的研究进展

刘丽，吴斌，曹文富，李延萍

(1.重庆医科大学中医药学院，重庆 400016； 2.重庆市中医院风湿病科，重庆 400021)

干燥综合征(Sjögren′s syndrome，SS)是一种病因不明的慢性淋巴细胞增生性疾病，典型特征是淋巴细胞浸润唾液腺和泪腺，主要表现为口眼干燥[1]。SS的分泌功能障碍除与淋巴细胞浸润腺体、促炎症细胞因子引起的上皮细胞凋亡相关外，还与自身抗体对抗毒蕈碱型3型乙酰胆碱受体(muscarinic type 3 acetylcholine receptor,M3R)的抑制有关，抗M3R抗体可作为M3R的拮抗剂抑制后者分泌[2]。毒蕈碱受体在副交感神经系统中具有神经递质的功能，在非神经组织如平滑肌中也具有激素样功能[3]。毒蕈碱受体共有5种亚型：M1R～M5R。在泪腺中，乙酰胆碱结合M3R促进腺体分泌；在肌上皮细胞中，M3R促进泪液在泪腺管中的流动；在结膜杯状细胞中，M2R和M3R参与黏蛋白的分泌；在睑板腺中，毒蕈碱受体可调节睑板的分泌[4-5]。此外，乙酰胆碱参与M3R的副交感神经递质的释放，是胃肠道和内脏平滑肌收缩的关键介质。研究已证实，SS患者携带抗M3R的自身抗体，且抗M3R抗体在SS患者中具有较高的灵敏度和阳性率，但现有的检测方法仍需优化[6-7]。原发性SS(primary Sjögren′s syndrome，pSS)患者的抗SSA/Ro抗体、抗SSB/La抗体或唾液流速测试阴性，抗M3R抗体阳性，提示抗M3R抗体检测可用于pSS诊断[2，8]。现就外分泌腺功能受损机制、腺外机制及基于抗M3R抗体的治疗予以综述。

1 抗M3R抗体诱发SS的机制

1.1外分泌腺受损机制

1.1.1针对M3R第二细胞外环的抗体减少唾液分泌 M3R具有4个细胞外结构域，即N端区域、第一细胞外环、第二细胞外环和第三细胞外环，其中第二细胞外环是激动剂激活受体的关键。研究显示，在SS少年患者中，第二细胞外环的自身抗体阳性率较高[9]。M3R的第二细胞外环是毒蕈碱受体的免疫优势功能区，可被抗M3R抗体识别[6]，并在SS致病中起作用[10]；针对M3R第二细胞外环的抗体可以抑制M3R激动剂诱导的Ca2+增加，抑制Ca2+内流，导致SS患者唾液分泌减少。Sumida等[9]研究显示，只有针对M3R第二细胞外环的自身抗体才能抑制唾液腺细胞系Ca2+内流。此外，抗M3R抗体与SS干眼有关[11]，M3R第二细胞外环抗体抑制一氧化氮合酶的激活和环磷酸鸟苷的产生，并通过免疫刺激后释放一氧化氮导致泪腺组织损伤[9]。Chen等[12]用由自身B细胞表位和非自身T细胞表位组成的合成肽在小鼠中诱导了针对M3R第二细胞外环肽的自身抗体的免疫反应，结果显示该抗体能够结合外分泌腺，但不损害腺体分泌功能，提示针对M3R第二细胞外环肽的自身抗体在体内无致病性。然而，此结果不能排除M3R作为pSS致病性的自身抗原的可能性，因为线性或环状的M3R第二细胞外环的合成肽可能不足以模仿M3R的多个构象表位，且抗M3R抗体对唾液分泌的影响可能取决于不同表位，不能排除致病性表位位于受体的第二细胞外环之外。在所有M3R细胞外部分中，M3R抗体的抗第二细胞外环阳性最为常见[13]。可见，针对M3R第二细胞外环之外的自身抗体可能参与SS的发病机制，但详细的机制还有待深入研究。

1.1.2干扰离子通道导致腺体分泌受损 M3R在外分泌中起关键作用[7]，尤其在唾液的分泌中[11]。研究显示，M3R基因敲除的小鼠唾液腺M3R信号功能发生障碍，导致唾液分泌显著减少[14]。已知乙酰胆碱结合并激活唾液腺细胞的M3R，通过肌醇1，4，5-三磷酸及其受体引起细胞内Ca2+升高，进而激活顶膜的Cl-通道，诱导唾液分泌[9]。研究显示，SS患者的免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)抗体可抑制卡巴胆碱对细胞内游离Ca2+的诱导，降低腺泡细胞的Ca2+内流；抗M3R抗体通过减少Ca2+内流和结合唾液腺上皮细胞的M3R分子导致唾液功能障碍[9]。使用人类下颌下腺细胞系的功能分析表明，针对M3R第二细胞外环的抗体可抑制细胞Ca2+内流，抑制唾液分泌[15]。此外，SS衍生的IgG能够抑制毛果芸香碱诱导的大鼠腮腺腺泡细胞中水通道蛋白5转运，Lee等[15]研究证实抗M3R抗体与受体的结合可抑制水通道蛋白5转运至质膜，导致SS中液体分泌受损。抗M3R抗体同时也干扰唾液腺腺泡膜中副交感神经递质对离子通量的调节，一方面充当促炎分子前列腺素E2的诱导剂，进而抑制Na+，K+-ATP酶的活性；另一方面废除细胞膜上Na+，K+-ATP酶的作用，使净K+流出增加，减少唾液生成而出现口干的症状[16]。在SS外分泌障碍中，抗M3R抗体对离子转运的调节具有重要作用，其可通过减少Ca2+内流、抑制水通道蛋白5转运、干扰Na+/K+交换从而减少唾液的生成。

1.1.3T细胞受体免疫应答介导唾液腺炎症 SS患者唾液腺中M3R反应性T细胞和B细胞可诱导唾液腺炎。Iizuka等[17]研究显示，在40%的SS患者循环单核细胞中可检测到M3R反应性T细胞，且可鉴定出一些细胞表位，如M3R的4个细胞外结构域。T细胞的抗原特异性由T细胞受体决定，CD4+T细胞构成SS患者唾液腺和泪腺的大部分浸润细胞[13]。研究显示，自身反应性CD3+T细胞对M3R在唾液腺炎的发生发展中发挥关键作用[18]，其可导致唾液腺中的细胞浸润和上皮细胞破坏，引发自身免疫性唾液腺炎[11]。将M3R肽免疫的M3R-/-中的CD3+T细胞转移到Rag1-/-小鼠中，可导致小鼠唾液腺的淋巴细胞浸润和上皮细胞破坏，证明M3R反应性CD3+T细胞的免疫损害作用[17]。涎腺炎中的M3R分子有两个主要的T细胞表位，即N端区域肽和第一细胞外环肽[19]；其中，最主要的T细胞表位可能是M3R的第一细胞外环，因为T细胞可以识别M3R的第一细胞外环并同时产生γ干扰素和白细胞介素-17(interleukin 17,IL-17)，γ干扰素和IL-17是涎腺炎发病机制中的关键细胞因子[20]。Iizuka等[21]研究显示，M3R反应性T细胞中的Th17细胞产生的IL-17可以激活小鼠唾液腺中渗入的B细胞，从而诱发SS样涎腺炎。抗M3R抗体在M3R的细胞外结构域上具有多个B细胞表位，且部分SS患者携带了识别M3R的多个细胞外结构域的抗M3R抗体。Th17细胞可促进M3R抗体沉积于腺泡细胞，并抑制M3R介导的信号转导，导致唾液腺功能障碍[14]；且M3R反应性Th17细胞与pSS疾病活性评分和抗M3R抗体滴度呈正相关，筛选出M3R特异性Th17细胞并针对其进行靶向治疗是pSS潜在的有效治疗策略[13]。研究证实M3R反应性Th1细胞促进自身免疫涎腺炎的发展，抑制γ干扰素和IL-17的产生可有效减轻唾液功能障碍，提示IL-17和γ干扰素可作为SS治疗的潜在靶标[18]。由此可见，CD4+T细胞和M3R反应性CD3+T细胞浸润并破坏唾液腺，Th17细胞通过分泌γ干扰素、IL-17并促进抗M3R抗体的产生以抑制M3R的信号转导，从而引发唾液腺功能障碍，IL-17又可激活B细胞促发炎症，以上研究均表明T细胞和B细胞在靶向治疗SS中的潜力。

1.2腺体外机制

1.2.1自主神经功能障碍 胆碱能功能障碍是pSS自主神经功能异常的标志，在pSS患者中，抗M3R抗体可介导与pSS相关的腺体和自主神经功能障碍[22]。Kovács等[23]研究显示，多数pSS患者有胃肠道和泌尿系统的自主神经系统功能障碍。有研究使用复合自主神经症状量表进行问卷调查，结果显示，pSS患者心率变异性降低与分泌功能障碍、膀胱障碍、胃轻瘫和便秘等自主神经症状的严重性存在密切联系[24]。抗M3R抗体阳性与某些临床症状(如轻度的认知障碍和膀胱过度反应)显著相关，可抑制神经递质诱发的膀胱平滑肌收缩[25]。Lee等[25]研究显示，pSS患者患膀胱刺激性疾病的风险增加，观察到抗M3R抗体诱导的炎症细胞因子增加可驱动肥大细胞进入逼尿肌膀胱固有层，致使逼尿肌细胞的炎症细胞因子分泌增加，促进膀胱疼痛综合征的发生。抗M3R抗体参与神经免疫，有研究发现免疫球蛋白输注4周后抗M3R抗体活性被中和，而特异性自身抗体水平未发生改变，此结果为静脉输注免疫球蛋白治疗抗M3R抗体阳性患者的副交感神经功能障碍提供了理论依据[26]。自主神经功能障碍在pSS患者中较常见，提示pSS的另一种发病机制，可加重总体症状，并与全身性疾病活动度有关。

1.2.2胃肠道功能障碍 胃排空延迟和结肠运动障碍是pSS的常见特征。M3R在结肠和胃平滑肌收缩中发挥主要作用，抗M3R抗体对M3R神经传递信号的干扰和对平滑肌收缩的抑制可导致与SS患者胃肠道不适相关的症状[27-28]。研究显示，在缺乏M3R的小鼠体内，自身抗体并无以上作用，提示抗M3R抗体具有介导pSS胃肠道多种功能障碍的潜力，可抑制胃肠道中神经元介导的平滑肌收缩[29]，非竞争性抑制卡巴胆碱引起的结肠收缩[30]。由上可知，抗M3R抗体抑制M3R导致的平滑肌细胞收缩，并阻断神经元诱导的间接肌反应，进而引起一系列胃肠道不适症状，提示抗M3R抗体在pSS患者消化道症状方面的潜在治疗作用。

1.2.3干扰造血系统 抗毒蕈碱受体多肽抗体可通过阻断乙酰胆碱信号，在突触后水平阻碍副交感神经信号传递，使神经递质(如乙酰胆碱)分泌减少，导致造血系统功能障碍(如白细胞减少、血小板减少和血红蛋白减少)[10]。有报道称，SS中抗M3R抗体阳性患者的白细胞减少症发生率高于阴性患者，且抗SS-A抗体和IgG阳性率更高，病程更短[7]。He等[10]也证明抗M3R抗体与贫血、白细胞减少、血小板减少、类风湿因子和抗核抗体阳性呈正相关。关于白细胞减少的机制，一方面抗M3R抗体可诱导白细胞中质膜储留的M3R和主要组织相容性复合体Ⅰ类分子下调，随后通过自然杀伤细胞介导白细胞死亡；另一方面抗M3R抗体破坏T淋巴细胞上M3R的生理功能，进而降低对自分泌乙酰胆碱的刺激，逐渐抑制白细胞的增殖和存活[31]。可见M3R抗体可干扰血液系统，尤其是在SS患者的白细胞减少症中发挥作用，但仍需进一步研究揭示抗M3R抗体与造血系统功能障碍的其他机制。

2 基于抗M3R抗体的治疗

目前针对SS患者腺体分泌障碍的疗法分为局部替代疗法(人工泪液、人工唾液)和M3R的化学激动剂，对M3R激动剂的研究新进展为认识免疫系统与神经内分泌系统之间的联系提供了重要依据。研究表明，口服30 mg的西维美林可引起持续增加的唾液流动，持续流动时间较毛果芸香碱长4～6 h，且不良反应较毛果芸香碱轻[32]。此外，pSS IgG可增加膜M3R与主要组织相容性复合体Ⅰ类的相互作用，并诱导下颌下腺细胞的内化(受体的单体与二聚体发生相互转换可阻碍受体的内吞)，减少信号转导，导致M3R功能逐步丧失，阻碍唾液腺的分泌。Kim等[33]研究表明，pSS IgG诱导的主要组织相容性复合体Ⅰ对M3R的内化作用可被胆固醇替代药物抑制，即通过富含胆固醇的微域与抗M3R自身抗体的内在结合，使带有M3R的主要组织相容性复合体Ⅰ膜显著下调，提示了pSS的潜在治疗方向。Asashima等[19]基于CD4+M3R反应性T细胞产生IL-17和γ干扰素，T细胞表位主要来自N1和1st肽区域这一理论进行研究，在设计的肽配体中，N端1-肽配体7(氨基酸15处的N→S)显著抑制γ干扰素的产生，且抑制涎腺炎的产生，可作为降低SS中病原性T细胞浸润唾液腺的潜在有用策略。Kudo等[34]研究证实，静脉注射M3R的T细胞，其表位N端1区域改变的肽配体可以抑制涎腺炎；口服使用表达N端1-肽配体7的水稻种子可通过抑制M3R特异性γ干扰素和IL-17的产生以及增强调节性T细胞，显著恢复已减少的唾液流量，抑制涎腺炎。研究显示，视黄酸相关的孤儿受体γt的拮抗剂可抑制M3R特异性T细胞产生IL-17和γ干扰素，改善涎腺炎的预后，表明小分子抑制剂可以靶向治疗M3R相关的涎腺炎[18]。Kumar等[26]研究证实，静脉注射免疫球蛋白可逆转抗体对乙酰胆碱释放的抑制作用，但对乙酰胆碱的基础释放并无显著影响，表明静脉注射免疫球蛋白可能逆转抗体介导的胆碱能功能障碍，从而逆转神经和肌源性M3R失活。以上研究表明，针对抗M3R抗体致病的不同机制，存在不同系列的有效治疗方法。

3 展 望

抗M3R抗体存在于SS患者中并参与SS的发病机制。随着SS的进展，患者体内抗M3R抗体浓度或亲和力越来越高，这可能与病灶数量增加、唾液腺分泌功能受到抑制以及炎性损害有关。除在SS中作为病原学抗体外，抗M3R抗体也可能成为潜在的诊断标记和治疗靶标。在外分泌障碍方面，M3R的第二细胞外环被视为受体上的免疫优势功能区，抗M3R抗体与M3R结合可抑制水通道蛋白5转运，干扰Ca2+内流，发挥M3R拮抗作用；并可下调M3R的表达导致唾液分泌减少。M3R反应性T细胞通过分泌IL-17和γ干扰素诱导自身免疫性唾液腺炎，进而导致腺体功能的障碍。此外，抗M3R抗体还可介导与SS相关的自主神经功能障碍，减少神经递质的分泌，引起胃肠道及血液系统等腺外表现。对M3R及其抗体的研究可为SS的诊断及治疗提供新视角，已有研究证明毒蕈碱M3激动剂有助于SS的治疗，未来仍需深入探索以提高SS的诊疗水平。