循环肿瘤细胞检测在鼻咽癌诊疗中的研究进展

邓伟明，韦嘉章，李敏，瞿申红

(1.广西医学科学院 广西壮族自治区人民医院耳鼻咽喉头颈科，南宁 530021； 2.广西医科大学研究生院，南宁 530021)

传统肿瘤疾病主要通过组织活检和影像学检查结果进行诊断。影像学检查对微小瘤体诊断的准确率较低，只有当肿瘤直径>5 mm时，影像学检查才能发现，而瘤体直径>1～2 mm时即开始有血管新生[1]。因此，影像学检查具有显著的滞后性。液体活检技术的出现，为肿瘤的诊断与动态监测提供了新方法。液体活检是指通过血液、尿液、脑脊液等体液检测肿瘤的循环成分。在肿瘤形成和发展过程中，部分肿瘤细胞由原发灶或转移灶脱落进入外周血液，因此这部分细胞又被称为循环肿瘤细胞(circulating tumor cell，CTC)。CTC检测是近年新兴的液体活检的代表，与传统组织病理活检相比，CTC检测具有便捷、无创、实时的优点[2-4]。目前，CTC检测已广泛用于肿瘤疾病的诊断和患者预后的评估。鼻咽癌是一种地理分布极不平衡的头颈部恶性肿瘤，在我国南方尤其是粤语方言地区发病率较高，但在世界大部分地区却十分罕见[5]。据统计，我国鼻咽癌平均发病率约为2.31/10万，显著高于世界平均水平(1.2/10万)和东亚地区平均水平(1.8/10万)[6]。由于缺乏特异性症状和有效的早期诊断方法，许多鼻咽癌患者就诊时已处于疾病进展期。我国的鼻咽癌大部分为未分化非角化性癌，对放疗较敏感。随着放疗技术的不断发展，鼻咽癌患者的局部控制率与临床预后均显著改善，但仍有部分患者出现局部复发和远处转移，最终导致肿瘤相关性死亡。近年，随着液体活检技术的不断发展完善，CTC检测在肿瘤诊疗中的作用越来越受到关注[7-10]。现就CTC检测在鼻咽癌诊疗中的研究进展予以综述。

1 CTC特性

CTC以不同形态存在于外周血，既有单个细胞CTC，也存在CTC细胞簇(CTC≥3个细胞)，这些CTC细胞簇也被称为循环肿瘤微栓子，在恶性肿瘤转移中起重要作用，且循环肿瘤微栓子比CTC更具侵袭性、转移潜能以及对凋亡的抵抗力[11-12]。与外周血中只有CTC的患者相比，外周血中出现循环肿瘤微栓子的肿瘤患者无进展生存期、总生存期均显著缩短[13]。CTC具有不同的细胞表型，包括上皮细胞型CTC、上皮与间质细胞混合型CTC和间质细胞型CTC，细胞表型可反映肿瘤细胞的恶性程度，其中间质细胞型CTC较其他表型CTC具有更强的迁移和侵袭能力[14]。在肿瘤细胞增殖过程中，CTC可发生上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)，主要表现为上皮细胞标志物(如上皮细胞黏附分子、细胞角蛋白)下调和间质细胞标志物(如波形蛋白、螺旋蛋白)上调[15-16]。研究表明，在评估肝细胞癌的转移以及确定治疗方案时，检测波形蛋白阳性的CTC较所有的CTC可能更具价值[17]。此外，EMT可协助CTC进入外周血液，使细胞获得更强的侵袭能力，从而促进肿瘤的转移[18-19]。

2 CTC检测技术

2.1CTC的富集 外周血中CTC的数量极少，平均每105～107个血细胞有1个CTC[20]，特别是在肿瘤早期，CTC的浓度更低。因此，敏感性高、特异性强的检测分析方法对实现最大限度的CTC富集至关重要。根据CTC的生物学特性(蛋白质标志物的表达)和物理特性(大小、密度、可变形性等)，可以实现对CTC的分离和富集。

2.1.1膜过滤技术 与外周血细胞相比，CTC具有更大的核质比和体积[21]。膜过滤法是指利用CTC与外周血细胞体积的差异，通过8 μm孔径的滤过膜分离血细胞，从而获得CTC[22]。膜过滤技术操作简单，具有便捷、高效、价廉等特点，且分离出的CTC不受其表面抗原上皮细胞黏附分子、细胞角蛋白等影响[23]。血液中存在大小不等的CTC，部分体积较小的CTC能够通过滤过膜，而体积较大的外周血细胞则无法通过滤过膜，因此易出现假阴性或假阳性结果。此外，即使滤过膜不堵塞，也很难完全从外周血中分离提取出高纯度的CTC，因此膜过滤技术会影响CTC的纯度。

2.1.2密度梯度离心技术 密度梯度离心技术是指利用细胞沉降系数的差异来分离细胞。根据斯托克斯定律，颗粒的沉降速率与颗粒的大小和密度成正比，同时与悬浮液的密度也成正比，因此，含有不同类型细胞的混合物经离心分离后，细胞会根据其自身密度以不同速率通过密度梯度，从而得到不同的分层区域[21]。基于外周血液中细胞密度的不同，在外周血中加入特定的分离液，经过离心后由下至上依次得到红细胞、粒细胞、离心液和单核细胞，而CTC、血浆在最上层[24]。密度梯度离心法具有成本低、简单可靠等优点，同时可保留CTC的活性。但在操作过程中混入了分离液会导致CTC部分损失；此外，部分白细胞与CTC密度接近，不易被清除，导致CTC纯度较低。

2.1.3免疫磁珠富集技术 免疫磁珠富集法是将抗体与磁珠上的细胞表面抗原结合，形成特异抗原抗体复合物，然后通过磁场的吸附作用将CTC分离出来。根据细胞表达抗原的不同，免疫磁珠富集法可分为阳性分选和阴性分选[25]。阳性分选是针对上皮来源的肿瘤细胞标志物(如上皮细胞黏附分子、细胞角蛋白)与连接有磁珠的特异性单抗结合，外加磁场吸附作用，从而分离出CTC。阳性分选依赖上皮细胞黏附分子、细胞角蛋白等抗原的表达，肿瘤细胞在迁移过程中常发生EMT，而上皮细胞标志物丢失可导致CTC漏检，出现假阴性结果[26]。阴性分选是利用外周血中表达的抗原(如CD45)与磁珠表面的抗体特异性结合，去除白细胞而富集CTC。阴性分选特异性高，可避免EMT的影响，因此临床上多采用阴性分选技术进行CTC检测，但缺点是捕获到的CTC纯度相对较低。

2.1.4CanPatrolTMCTC富集技术 CanPatrolTMCTC富集技术充分结合了免疫磁珠富集技术和膜过滤技术的特点，在滤过前，首先通过红细胞裂解去除红细胞，然后通过磁珠分离技术去除白细胞，最后将体积较大的CTC分离出来。CanPatrolTMCTC富集技术是一种基于过滤的方法，可提供单个CTC的形态学、免疫细胞学以及遗传学的表征。收集到的CTC可以通过免疫荧光、荧光原位杂交和基于聚合酶链反应的遗传分析进行鉴定。CanPatrolTMCTC富集技术的平均去白细胞效率为99.98%，CTC平均回收率不低于80%[27]；与单纯的免疫磁珠富集技术相比，CanPatrolTMCTC富集技术CTC平均回收率提高约22%[28]。免疫磁珠技术和膜过滤技术两者优化后的CanPatrolTMCTC富集技术灵敏度更高，可复性更好。

2.2CTC的鉴定 目前CTC的鉴定技术主要包括流式细胞技术、免疫荧光技术、聚合酶链反应技术以及荧光原位杂交技术等。流式细胞技术综合单克隆抗体、免疫细胞化学、激光以及电子计算机技术等，使荧光标记的抗体与CTC表面抗原特异性结合，然后通过流式细胞仪快速定量分析CTC。流式细胞术精确度高、准确性好，但灵敏度差，成本高。免疫荧光技术是目前应用广泛的CTC鉴定技术，其根据抗原抗体反应原理，借助细胞角蛋白、CD45等荧光抗体和荧光染料对CTC染色，然后在荧光显微镜下对染色的CTC进行分析鉴定。聚合酶链反应是一种灵敏度较高的鉴定技术，通过检测肿瘤细胞信使RNA的表达水平鉴定CTC，但假阳性率较高，且细胞形态易受到破坏，不利于CTC的进一步使用。荧光原位杂交技术结合了分子生物学与细胞遗传学的特征，利用荧光素标记的核酸探针对CTC进行鉴定，且具有较高的灵敏度和特异度。

3 CTC检测在鼻咽癌诊疗中的应用

3.1早期诊断 鼻咽癌的早诊断、早治疗是降低患者病死率、提高生存率的关键。目前，鼻咽癌的诊断大多依靠EB病毒血清学检测及DNA分析或影像学检查，组织病理学活检仍是确诊的金标准。EB病毒血清抗体标志物与血浆EB病毒DNA检测均可用于鼻咽癌的早期筛查，但特异度不高。而影像学和病理学检查也存在明显的局限性。CTC在鼻咽癌各个阶段的表达不同，因此检测外周血中的CTC对鼻咽癌的早期筛查及诊断均具有积极作用[29]。毛燕娇等[30]采用CanPatrolTMCTC富集技术分析49例鼻咽癌患者与20例正常人CTC的表达水平，结果发现，仅在鼻咽癌患者肿瘤细胞中检测到CTC，而在正常人或非肿瘤细胞中并未检测到CTC。该发现与吴君心等[31]、伍勇等[32]、蔡清清等[33]的研究结论一致。因此，CTC可作为鼻咽癌早期辅助诊断的标志物。

3.2辅助分期 TNM分期是影响鼻咽癌患者治疗的重要因素。临床上鼻咽癌的诊断和TNM分期主要依靠磁共振成像等影像学技术，但影像学具有迟滞性和不稳定性，不能及时评估鼻咽癌的疗效。而CTC检测不仅可弥补影像学和组织病理学的局限，还能反映肿瘤整体异质性的特征，特别是对于已经发生转移或接受过治疗的患者，CTC具有显著优势。Yu等[10]指出，鼻咽癌晚期(Ⅳ期)患者总CTC计数显著高于鼻咽癌Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ期患者，其CTC中位数水平也高于鼻咽癌早期患者。Si等[34]应用CanPatrolTMCTC富集技术和经典原位杂交实验分离、鉴定鼻咽癌患者的CTC，结果发现，CTC水平与鼻咽癌分期密切相关，且鼻咽癌患者总CTC计数、间质型CTC计数以及间质型CTC占总CTC的比例均与鼻咽癌的临床分期呈正相关，而混合型CTC计数与鼻咽癌的临床分期呈负相关。以上研究表明，CTC的分型检测结果可以作为TNM分期的补充手段。然而，另一项关于CTC与头颈部鳞状细胞癌临床特征的前瞻性研究显示，CTC与头颈部鳞状细胞癌分期无相关性[35]。Li等[36]的研究结果也证实鼻咽癌患者CTC的阳性率与TNM分期无相关性。此外，He等[29]发现，CTC在鼻咽癌各分期均有表达，但与TNM分期无关。虽然鼻咽癌患者存在CTC，但CTC与TNM分期的相关性仍存在较大争议。

3.3疗效评价 临床医师可根据CTC检测结果及时有效地调整治疗方案，提高鼻咽癌患者的疗效。有研究发现，鼻咽癌患者的CTC水平与疗效具有一定相关性[36-37]。曾伟华等[38]利用抗体标记联合流式细胞仪检测60例晚期鼻咽癌患者的CTC水平，结果发现，与治疗前相比，治疗后3个月患者的CTC计数及阳性率均显著降低，同时CTC阴性患者的缓解率显著高于CTC阳性患者，差异有统计学意义。Zhang等[39]研究发现，经2～4个周期的化疗后，鼻咽癌患者的CTC计数显著降低，表明CTC数量变化与治疗反应相关，治疗后患者的CTC数量减少表明鼻咽癌患者获得显著疗效。由此可见，CTC在评估鼻咽癌疗效方面具有良好的应用价值。

3.4预后评估 复发或远处转移是肿瘤患者预后不良的重要指标，而肿瘤的复发及转移均与CTC密切相关[40]。研究表明，CTC的存在与乳腺癌、前列腺癌、结直肠癌、肝癌、肺癌等患者的不良预后相关，而在肿瘤治疗过程中CTC计数会发生改变，表明CTC可作为监测肿瘤患者预后的潜在指标[7，41-45]。也有报道指出，CTC是鼻咽癌患者预后不良的独立危险因素，CTC计数增加表明晚期鼻咽癌患者的预后不良，且与EB病毒DNA检测相比，CTC诊断远处转移的特异度显著升高，而CTC联合EB病毒DNA检测还可提高临床判断鼻咽癌患者预后的准确率[46-47]。Wen等[48]研究证实，间质细胞型CTC与鼻咽癌患者无进展生存期显著相关，化疗后血液中未检测到间质细胞型CTC的患者无进展生存期显著延长，表明间质细胞型CTC可作为预测患者无进展生存期的重要指标。另有研究表明，鼻咽癌患者的CTC计数与转移也具有相关性，发生转移的鼻咽癌患者CTC平均计数显著高于未转移患者，且差异有统计学意义[49]。此外，Si等[34]研究发现，间质型CTC与鼻咽癌的转移呈显著正相关，尤其是淋巴结转移，同时混合型CTC、间质型CTC占总CTC的比例也与鼻咽癌淋巴结转移呈正相关。

3.5指导治疗 肿瘤治疗已进入个体化治疗时代，基因检测可为肿瘤治疗提供最有利的信息，依据基因分子结构的特点，针对不同基因靶点选择合适治疗药物，可以达到精准医疗的目的。血液中的CTC携带肿瘤的全部基因，通过监测鼻咽癌患者CTC的表型变化，有助于判断CTC的侵袭性和转移能力；同时，对CTC进行基因分析还可为临床医师提供更准确、更完整的信息，有利于鼻咽癌患者个体化治疗的实施。Zhang等[39]监测12例鼻咽癌患者接受吉西他滨联合顺铂化疗后外周血中CTC核型的变化，结果发现，携带三倍体和多倍体CTC的患者较携带四倍体CTC的患者更易出现耐药，表明CTC的核型分析可评价化疗的敏感性与耐药性，是鼻咽癌患者疗效的重要预测因子。Fu等[50]研究表明，鼻咽癌患者外周血中人端粒酶逆转录酶信使RNA的表达与肿瘤浸润范围、淋巴转移及远处转移均密切相关，而放化疗可抑制人端粒酶逆转录酶基因的表达，因此检测鼻咽癌患者CTC中人端粒酶逆转录酶信使RNA水平，可以为鼻咽癌患者的早期诊断、治疗以及预后提供重要信息。可见，研究鼻咽癌患者外周血中CTC的基因表达对治疗的选择具有重要意义，但仍需更充分的证据验证其应用价值。

4 小 结

CTC检测技术是一种非侵袭性的生物分析方法，具有灵活、便捷、无创的优点。CTC检测在肿瘤各治疗阶段均可进行，可实时监测肿瘤动态变化、精准地了解肿瘤的遗传学信息，为肿瘤患者的个体化诊疗提供依据。目前CTC在鼻咽癌患者的临床应用中已展现出良好的前景，但仍存在某些技术难题有待解决，如目前的技术尚不能同时兼顾高特异度与高灵敏度、对CTC阳性的判断尚无统一标准等。因此，改进目前的CTC检测技术，不仅有助于指导鼻咽癌的治疗，还可改善患者的预后。相信随着科学技术的进一步发展，未来CTC检测技术会不断完善，其临床应用价值也将显著提高。