结核分枝杆菌分子诊断方法研究进展

欧洋华，江咏梅

(四川大学华西第二医院检验科 出生缺陷与相关妇儿疾病教育部重点实验室，成都 610041)

结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)于1882年由Robert Koch首次提出并认定为结核病的病因[1]。结核病是21世纪最重要的公共卫生问题之一，居全球感染性疾病病死率之首[2]。世界卫生组织报告显示，2019年全球新发结核病1 000万例，新增患者中约50万例对利福平(rifampin，RIF)耐药，其中78%为耐多药结核病[3]。早诊断、早隔离、早治疗是减少肺结核发病和死亡的关键。然而，儿童结核病由于临床表现不典型，标本获取困难，60%～70%的患儿无法通过传统实验室检查得到病原学确诊[4]。此外，潜伏期结核、亚临床结核、肺外结核、获得性免疫缺陷综合征并发结核也是临床诊断的重点和难点。值得警惕的是，诊断滞后可能导致个体化治疗的延误、MTB的传播和耐药菌株的产生。因此，寻找快速、高效、准确的诊断方法对结核病尤其是耐药结核病的早期发现至关重要。目前，结核病的病原学诊断金标准为痰涂片抗酸染色、MTB培养和药敏试验，但因MTB生长缓慢，以上检查存在镜检阳性率低、操作繁琐、培养周期长、特异度差等缺点。近年来，分子生物学诊断技术的快速发展有望解决这一难题，包括实时荧光聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)、环介导恒温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)、线性探针(line probe assay，LPA)和全基因组测序(whole-genome sequencing，WGS)等，其优势在于检测周期更短、特异度和生物安全性更高[5]。目前，正在进行临床前研发的诊断结核分子的新技术已超过50种[6]。现就MTB分子诊断方法研究进展予以综述。

1 实时荧光PCR技术

2010年，美国Cepheid公司研发推出的MTB/RIF耐药实时荧光定量核酸扩增技术(Xpert MTB/RIF)是以MTB rpoB基因为靶基因，实现全自动DNA提取和扩增，同时检测MTB及RIF的耐药性，报告周期仅为2 h，可用于灭活或未灭活的呼吸道样品、脑脊液、胸腹水、尿液等，具有特异度高、灵敏度高、简便快速、安全性好等优点[7]。2011年，世界卫生组织(World Health Organization，WHO)推荐将Xpert MTB/RIF用于耐多药结核及获得性免疫缺陷综合征并发结核的早期检测，对于非耐药高风险人群及未合并获得性免疫缺陷综合征的患者，Xpert MTB/RIF可作为涂片或胸部X线检查之外的辅助检测[8]。2013 年，WHO进一步扩展了Xpert MTB/RIF的适用范围，推荐其替代涂片、培养等技术用于肺外结核的快速诊断[9]。

2018年，Cochrane更新了关于 Xpert MTB/RIF检测肺外结核的系统评价。以细菌培养为金标准，Xpert MTB/RIF在不同类型肺外标本中的灵敏度存在差异(如在胸膜组织可达31%，在骨关节液可达97%)，且其特异度的变化小于灵敏度的变化，在脑脊液、胸膜液、尿液和腹膜液中，Xpert MTB/RIF特异度≥98%[10]。说明Xpert MTB/RIF的检测结果易受样本类型和量的影响。2019年，Cochrane更新了关于Xpert MTB/RIF诊断肺结核和RIF耐药的系统评价，该方法检测肺结核和RIF耐药的灵敏度分别为85%和96%，特异度均为98%，对涂片阳性和阴性结核病的灵敏度分别为98%和67%，在合并人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)感染和未合并HIV感染的患者中灵敏度分别为88%和81%，提示Xpert MTB/RIF对含菌量低标本和获得性免疫缺陷综合征患者的灵敏度较低[11]。对于儿童肺结核，2020年Cochrane系统评价显示，Xpert MTB/RIF对胃液标本的灵敏度最高(73%)，其次为痰液(64.6%)和粪便(61.5%)，鼻咽标本的灵敏度最低(45.7%)，所有标本特异度均>98%[12]，提示Xpert MTB/RIF在儿童肺结核中具有较好的诊断价值。

为克服Xpert MTB/RIF的缺点，新一代Xpert MTB/RIF Ultra增加了两种MTB检测分子靶标(IS1081和IS6110)以提高检测灵敏度，扩大了DNA扩增室以提高样本容纳量，将MTB的菌株检测下限从112.6 CFU/mL降低至15.6 CFU/mL，大大提高了检测效率[12]。同时改进了对沉默突变的解读，减少了混合感染和含菌量低标本中RIF耐药检测的假阳性结果，因此灵敏度较第一代Xpert MTB/RIF更高，但特异度下降[13]。Dorman等[14]的一项多中心研究结果显示，在肺结核的诊断中，Xpert MTB/RIF Ultra和Xpert MTB/RIF的总体灵敏度分别为88%和83%，特异度分别为96%和98%，其中Xpert MTB/RIF Ultra在涂片阴性结核患者和HIV阳性结核患者中的灵敏度更高。同样，在肺外结核的诊断中，与Xpert MTB/RIF相比，Xpert MTB/RIF Ultra的总体灵敏度更高，特异度更低[15]，提示Xpert MTB/RIF Ultra在标本含菌量低、获得性免疫缺陷综合征并发结核和肺外结核患者中的灵敏度优于Xpert MTB/RIF，但由于特异度降低，当核酸检测结果为弱阳性时应结合临床特点进行具体分析。而Xpert试剂盒的扩展版本——广泛耐药结核实时荧光定量核酸扩增检测技术可同时扩增8个MTB相关基因和启动子，检测对异烟肼、氟喹诺酮、乙硫异烟胺和二线注射药物的耐药性，检测时间缩短为90 min。与第一代测序技术相比，该方法对除乙硫异烟胺外药物耐药性的检测灵敏度为94%～100%，特异度为100%[16]。

此外，还有其他商业化的检测试剂盒，包括RealTime MTB (Abbott，美国)[17]、BD MAX MDR-TB (Beckton,Dickinson and Company，美国)[18]和FluoroType MTBDR (Hain Lifescience，德国)[19]等，对结核诊断和RIF耐药的检验效能与Xpert MTB/RIF一致，但缺乏大规模研究数据，尚未得到广泛应用。

2 恒温扩增技术

恒温扩增技术不依赖于热循环扩增设备，仅需在恒定温度下完成扩增，反应迅速，灵敏度高但特异度相对较低。

2.1LAMP 日本东京Eiken Chemical公司开发了一种基于LAMP的MTB定性检测试剂盒，包括样品制备、LAMP扩增和反应管紫外荧光的目视检测 3个步骤，可在90 min内快速检出MTB[20]，具有特异度高、成本较低、操作简便、安全性好等优点。一项Meta分析显示，LAMP对肺结核诊断的灵敏度为89.6%，特异度为94%[21]。此外，LAMP对涂片阳性标本的灵敏度高于涂片阴性标本(分别为92.0%和58.8%)[22]。

对肺外结核样本LAMP诊断性能的Meta分析显示，与复合参考标准相比，以MPT64为检测靶标的LAMP灵敏度、特异度分别为86%和100%，以IS6110为检测靶标的分别为75%和99%，提示LAMP在检测肺外结核方面具有良好的诊断效果，且MPT64 LAMP的诊断效果优于IS6110 LAMP[23]。Dayal等[24]研究了LAMP在儿童肺结核中的诊断性能，将痰培养作为金标准，结果显示MPT64 LAMP和IS6110 LAMP的灵敏度分别为94.9%和89.8%，说明LAMP在儿童肺结核中是有效的诊断方法。因此，WHO于2016年推荐LAMP替代痰涂片镜检用于结核病的诊断[25]。

2.2交叉引物扩增技术(crossing priming amplification，CPA) 中国杭州优星生物科技股份有限公司开发的EasyNAT TB诊断试剂盒是采用CPA对MTB进行定性检测[26]，2014年被国家食品药品监督管理总局批准用于检测结核病。以MTB培养为金标准，国内研究报道CPA检测MTB的灵敏度为84.1%～85.5%，特异度为96.8%～97.8%[27-28]。国外研究报道其灵敏度和特异度分别为66.7%和100%，其中对于痰涂片阴性标本的检测灵敏度较低[29]。Bholla等[30]评价了EasyNATTMTB试剂盒诊断儿童肺外结核(结核性淋巴结炎)的性能，结果显示其灵敏度和特异度分别为19%和100%，故认为EasyNAT不适用于肺外结核的诊断。

2.3实时荧光核酸恒温扩增检测技术(simultaneous amplification and testing,SAT) SAT以MTB特异的16S核糖体RNA为靶点，采用闭管法结合实时荧光检测，可有效控制气溶胶污染，且操作简单，对仪器的要求较低，检测结果稳定[31]。由于RNA只在活菌中存在，相比其他以DNA为检测靶标的技术，SAT可用于检测疾病活动性、监测用药疗效和判断治愈程度[32]。Deng等[33]评估了国家食品药品监督管理总局批准的6种商用肺结核分子诊断方法的诊断效能，包括Xpert MTB/RIF、线性探针、LAMP、CPA、SAT和PCR，结果显示Xpert MTB/RIF的灵敏度最高，CPA的特异度最高，而SAT的灵敏度和特异度最低。

3 LPA

LPA基于多重PCR扩增，与预先固化在试纸条上的特异性DNA探针杂交，对杂交带进行酶联免疫比色检测，通过肉眼观察条带显色情况即可判断基因突变情况。目前，WHO推荐用于痰涂片阳性样本初始耐药性筛选的LPA包括Genotype MTBDRplus VER 1.0/2.0、Nipro NTM+MDR-TB和Genotype MTBDRsl VER 1.0/2.0。

Genotype MTBDRplus VER 1.0/2.0通过筛选rpoB、katG和inhA启动子的突变，可同时检测MTB RIF和异烟肼的耐药性[34]。研究显示，MTBDRplus VER 1.0对RIF耐药结核的检测准确性较高，灵敏度为98.1%，特异度为98.7%[35]。不同研究异烟肼耐药结核检测的结果差异较大，灵敏度为57%～100%，特异度为99.5%，其原因可能为katG、inhA突变率存在地域差异[36]。

Nipro NTM+MDR-TB通过靶向rpoB、katG和inhA启动子检测耐多药结核[36]。NTM+MDR-TB对RIF耐药检测显示出较高的特异度(97.45%～100%)，但对于异烟肼的耐药检测特异度略下降(96.43%～97.83%)，两种药物的检测灵敏度在不同研究中差异较大(50%～100%)，不能得出统一的结论[36-38]。

Genotype MTBDRsl VER 1.0可靶向gyrA基因检测氟喹诺酮类耐药，靶向rrs基因检测二线注射药物耐药，靶向embB基因检测乙胺丁醇耐药。MTBDRsl VER 2.0移除了embB的靶区，可检测与氟喹诺酮类(gyrA和gyrB基因)和二线注射药物(rrs和eis基因)耐药性相关的突变，VER 1.0只适用于涂片阳性的标本，VER 2.0则适用于涂片阳性或阴性的标本。MTBDRsl是目前唯一可检测广泛耐药结核的分子诊断技术，于2016年获得WHO批准，适用于痰涂片阴性或阳性、肺结核或肺外结核的标本[39]。

Theron等[40]更新了关于MTBDRsl对氟喹诺酮类和二线注射药物耐药的检测性能系统评价，在痰涂片阳性标本中，MTBDRsl VER 1.0检测氟喹诺酮类耐药的灵敏度和特异度分别为86.2%和98.6%，检测二线注射药物耐药的灵敏度和特异度分别为87.0%和99.5%，检测广泛耐药结核的灵敏度和特异度分别为69.4%和99.4%。MTBDRsl VER 2.0在不同地域研究中的诊断性能存在差异，在痰涂片阳性标本中检测氟喹诺酮类耐药的灵敏度为73.6%～100%，特异度为98%～100%，检测二线注射药物耐药的灵敏度为64.7%～89.2%，特异度为90%～99.3%，对广泛耐药结核的检测灵敏度为83%～87%，特异度为59%～100%[41-44]。

4 基因芯片技术

基因芯片也称DNA微阵列，是将特定的DNA探针和寡核苷酸等有序固定于固相支持物上形成微阵列后，与荧光标记的靶分子进行PCR反向杂交，其杂交信号由荧光扫描仪自动检测，且能够在同一时间内平行分析大量的基因，进行大信息量的筛选及检测分析，但存在芯片制备复杂、仪器设备昂贵、样品标记繁琐、检测成本高等缺点[45]。目前，WHO没有批准任何基于基因芯片的检测耐多药结核的方法，大多数测试仍在开发中[5]。中国广州博奥生物有限公司开发的基因芯片产品(GeneChip MDR试剂盒)由国家卫生和计划生育委员会批准上市，是市场上唯一一种基于DNA微阵列的检测技术，该技术能够快速检测标本中MTB的ropB、katG和inhA等突变基因，最多可同时检测25个基因组，现GeneChip MDR试剂盒已在中国多个省份广泛应用于研究中[46]。研究显示，基因芯片对RIF耐药的灵敏度和特异度分别为87.56%和97.95%，对异烟肼耐药的灵敏度和特异度分别为80.34%和95.82%[47]。

5 熔解曲线法

MeltPro TB是由中国厦门致善生物公司开发的一种基于荧光PCR熔解曲线法的新型分子检测试剂盒，主要用于检测一线和二线抗结核药物的耐药性[48]，该试剂盒采用闭管法，避免了扩增产物的污染，检测可在3 h内完成。耐药基因的突变会打乱碱基的组成成分，导致DNA的熔解温度降低，在PCR体系中加入两端分别标记有荧光基团与淬灭基团的探针，计算荧光值和DNA熔解温度的负倒数，获得熔解曲线，从而得出靶标基因的序列信息。2013年，国家食品药品监督管理总局批准MeltPro TB用于对RIF和异烟肼耐药的定性检测。MeltPro检测RIF耐药的灵敏度为92%～96%，特异度为99%[49]，对异烟肼耐药的灵敏度和特异度分别为90.8%和96.4%[50]。对于二线药物，国内多中心试验评估MeltPro TB针对痰涂片阳性标本鉴别耐多药结核和广泛耐药结核的性能，其灵敏度分别为86.7%和71.4%[51]。

6 WGS

上述分子检测技术(如Xpert MTB/RIF和GenoType MTBDRplus/sl)只能识别有限数量的药物靶基因的特异性耐药突变，不能检测RIF耐药决定区外的突变或RIF耐药决定区内影响药物疗效的沉默突变，从而导致假阳性结果。在结核病的诊断中，识别这些类型的突变对于指导正确的临床治疗非常必要，而WGS有望解决这一问题。Cole等研究报道了MTB标准株H37Rv的完整基因组序列，其长度约为4 410 000碱基对，编码约4 000个基因[52]。WGS通过识别MTB基因组中与表型耐药性相关的突变，实现MTB及其耐药性的精确检测。目前，WGS已成功应用于MTB的菌种鉴定、基因分型、耐药检测和流行病学调查中[53]。研究显示，WGS对异烟肼、RIF、乙胺丁醇和吡嗪酰胺耐药的预测正确率分别为97.1%、97.5%、94.6%和91.3%[54]。尽管WSG在常规诊断和耐药结核病管理方面有明显优势，但仅在少数高收入国家和低结核病负担地区被纳入临床诊治流程，在我国多用于科学研究。因此，WGS在进入广泛临床应用前，还需对样本选择、细菌裂解、DNA提取、文库构建及测序平台等环节进行深入研究。

7 小 结

分子生物学的高速发展为结核病的诊断、管理和监测开辟了一条新的途径。与传统诊断方法相比，分子诊断技术可以减少周转时间，提高诊断性能，有利于临床更早进行个体化治疗，但仍存在以下问题：①现有检测技术对于含菌量低的标本(如痰涂片阴性肺结核、肺外结核、儿童结核、获得性免疫缺陷综合征并发结核)的诊断灵敏度有限；②在资源有限的国家，由于检测费用昂贵、实验室基础设备要求高、技术人员的标准化培训等挑战，分子诊断技术的应用受限；③MTB耐药与基因突变的确切关系仍未完全阐明，且存在未被发现的耐药基因，各种检测方法也均有缺点，分子耐药结果与所获得的药敏表型的相关性并不稳定，故联合表型药敏试验量化耐药水平仍非常必要。WGS虽具有广阔的应用前景，但因其测序成本昂贵，数据的分析和注释未达成共识，故目前尚未有在资源有限、结核病负担沉重的国家常规实施WGS的计划[3]。未来仍需致力于开发快速简便的新型分子检测技术，提高诊断性能的同时降低成本，以利于在资源有限但结核负担重的国家中推广实施。建立WGS的标准化检测流程，进一步挖掘结核病的分型、耐药和疗效预测的生物标志物，以加快临床转化过程。