M2亚型巨噬细胞对胃癌细胞迁移及上皮-间质转化的影响*

李 伟，郑 萍，赵绍林，周 颖，李海宁

(1.江苏省连云港市第一人民医院中心实验室 222001;2.江苏省连云港市第一人民医院检验科 222001；3.南京医科大学康达学院医学检验系，江苏连云港222000)

作为最主要的致死性恶性肿瘤之一，胃癌在我国的发病率和病死率始终居高不下，已成为威胁国民健康的公共卫生事件[1]。目前高转移率仍然是影响临床胃癌患者长期生存率的主要因素之一[2]。因此，阐明胃癌转移相关的病理学机制将是探寻胃癌有效治疗靶点的重要途径。

肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages,TAMs) 是肿瘤微环境中的主要免疫细胞之一。在肿瘤发生、发展的不同时期，TAMs在经典活化 (M1) 与替代活化(M2)等亚型之间发生极化，分别发挥抗肿瘤与促肿瘤作用[3]。目前，肿瘤局部浸润的M2亚型TAMs已被证实与肿瘤转移密切相关，并且提示预后不良[4]。上皮-间质转化 (epithelial-mesenchymal transition,EMT)作为重要的细胞生物学进程之一，在肿瘤转移的多个环节发挥关键作用[5]。发生EMT后的上皮细胞，其表型特性向具有干性、侵袭性、耐药性及远端器官转移性的方向转化[6]，是诱导肿瘤体内转移与复发的重要病理学因素。

本研究拟采用磁性活化细胞分选法(MACS)分离获得胃癌组织及外周血来源TAMs，并对其亚型进行鉴定。在体外共培养体系中，探讨胃癌组织来源TAMs (gastric cancer-derived tumor-associated macrophages,GC-TAMs) 对胃癌细胞迁移能力及EMT的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1细胞株

采用MACS体外分离GC-TAMs后，培养于含10% FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的RPMI1640中。人胃癌细胞株MKN-28由苏州大学第一附属医院赠予，并以含10% FBS的RPMI1640营养液培养。胃癌组织来源间充质干细胞 (gastric cancer-derived mesenchymal stem cells,GC-MSCs) 参照早期文献报道的方法进行分离[7]，并以含15% FBS的L-DMEM营养液培养。

1.1.2主要试剂

人肿瘤组织解离试剂盒和人CD14磁珠分选试剂盒均购自德国Miltenyi公司；RPMI1640营养液、FBS和胰酶购自美国Gibco公司；佛波酯(PMA)购自美国Sigma-Aldrich公司；Ficoll-Hypaque(1.077 g)淋巴细胞分离液购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司；抗人CD204-PE购自美国R&D公司；重组人细胞因子IL-4 (rhIL-4)购自爱必信(上海)生物科技有限公司；TRIzol试剂购自美国Invitrogen公司；RNA逆转录试剂盒购自美国Roche Diagnostics公司；RT-qPCR试剂盒购自日本TaKaRa公司；Transwell小室购自美国Corning公司；抗人CD204-PE抗体及PE同型对照购自美国R&D公司；抗人E-cadherin、vimentin和snail2均购自美国Cell Signaling Technology公司；抗人fibronectin和β-actin购自美国Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1GC-TAMs分离培养

选取连云港市第一人民医院胃癌切除术患者3例，病理确诊为胃腺癌，且术前均未接受任何放化疗。留取患者癌组织及癌旁组织(距癌变部位5 cm以上，且病理检查未见癌组织)，取材均获患者家属同意并签署知情同意书。以PBS冲洗清除新鲜癌组织表面血液后，将其剪成1 mm3小块并浸泡于抗生素溶液。利用gentleMACSTMOcto单细胞解离器(德国Miltenyi公司)及人肿瘤组织解离试剂盒将肿瘤组织解离为具有活性的单细胞悬液。按照人CD14磁珠分选试剂盒说明书操作分离获得GC-TAMs，同样方法分离所得癌旁组织来源巨噬细胞设为对照。

1.2.2外周血来源巨噬细胞分离培养

采用Ficoll-Hypaque(1.077 g)淋巴细胞分离液分离获得3例胃腺癌患者的外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)，健康体检者外周血分离所得PBMCs设为对照。本研究经连云港市第一人民医院医学伦理学委员会批准，患者及其家属知情同意。随后，利用CD14磁珠阳性分选法从PBMCs中分离CD14+细胞。流式细胞法检测分选所得细胞中CD14+细胞比例后，将其以5×105/mL的密度接种于6孔板中。50 ng/mL PMA体外刺激CD14+单核细胞24 h后，将其诱导分化获得巨噬细胞。所得巨噬细胞以20 ng/mL rIL-4继续刺激培养24 h可诱导获得M2亚型(阳性对照)。

1.2.3流式细胞检测

收集GC-TAMs及对应癌旁组织来源巨噬细胞或外周血来源巨噬细胞，以预冷PBS洗涤重悬。将所得细胞悬液与抗CD204-PE抗体于4 ℃避光孵育30 min，PBS洗涤重悬后上机检测，分析巨噬细胞免疫表型。

1.2.4RT-qPCR检测

收集GC-TAMs及对应癌旁组织来源巨噬细胞或外周血来源巨噬细胞，TRIzol裂解收集各组巨噬细胞后抽提RNA以检测巨噬细胞亚型相关基因。收集GC-TAMs共培养处理的胃癌细胞MKN-28并抽提RNA后，检测胃癌细胞中EMT相关基因表达情况。利用NanoDrop-2000分光光度计对总RNA的纯度和含量进行分析，选择吸光度 (A260/280 nm)为1.8～2.0的标本开展实验。按照RNA逆转录试剂盒说明书操作将RNA逆转录为cDNA。巨噬细胞亚型相关基因及胃癌细胞EMT相关基因引物均采用Primer Software软件(美国Invitrogen公司)设计，并由上海生工生物技术有限公司合成，见表1、2。qPCR反应混合体系(20 μL)中分别含有2 × SYBR Taq (Tli Plus) 10 μL、10 μmol/L上下游引物各0.4 μL、50 × ROX Reference Dye Ⅱ 0.4 μL及cDNA模板2 μL，各qPCR反应均重复3次。以β-actin为内参，采用2-ΔΔCt分析方法计算各基因的相对表达量。

表1 巨噬细胞亚型相关基因扩增引物序列

表2 胃癌细胞EMT相关基因扩增引物序列

1.2.5细胞培养上清液的收集

将体外分离所得GC-TAMs和癌旁组织来源巨噬细胞接种于35 cm2培养瓶中，于5% CO2、37 ℃条件下培养48 h后分别收集细胞培养上清液(GC-TAM-CM组、GC-Mac-CM组)。1 200×g离心10 min去除细胞碎片后以0.22 μm孔径滤器过滤，分装后冻存于-140 ℃深低温冰箱备用。GC-MSC-CM组采用同样方法收集保存以设为阳性对照，未经过细胞上清处理的为对照组。

1.2.6Transwell迁移实验

将胃癌细胞MKN-28以4×104个/孔的密度接种于24孔板中的Transwell小室上层(8.0 mm孔径)，下室加入含20% GC-TAM-CM的无血清营养液。37 ℃培养16 h后，取出Transwell小室，将孔膜上层未迁移的细胞刮除，下层以4.0%多聚甲醛和0.5%结晶紫固定、染色。倒置显微镜下观察并随机选取8个视野(×200)计数迁移细胞。

1.2.7Western blot检测

为评价GC-TAMs对胃癌细胞EMT的影响，将MKN-28与20% GC-TAM-CM共培养5 d后，收集肿瘤细胞，裂解液冰上提取蛋白。取等量蛋白在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离蛋白，湿转法转至PVDF膜并室温封闭1 h。加入一抗(抗人E-cadherin、fibronectin、vimentin、snail2和β-actin)后，4 ℃摇床孵育过夜，TBST洗膜3次，每次10 min。加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG和兔抗鼠IgG，室温摇床孵育2 h，TBST洗膜3次，加入ECL试剂显色。实验结果采用全自动化学发光凝胶成像系统进行检测、分析。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 GC-TAMs及癌旁组织来源巨噬细胞亚型鉴定

GC-TAMs中CD204+细胞比例明显高于癌旁组织来源巨噬细胞，见图1A。与癌旁组织来源巨噬细胞比较，GC-TAMs中M2亚型相关基因CD163、CD204、CD206、IL-10和CCL-22的表达水平明显升高，而M1亚型相关基因IL-23 (p19)的表达水平明显降低，胃癌患者GC-TAMs以促肿瘤作用的M2亚型为主，见图1B。

2.2 胃癌患者外周血来源巨噬细胞亚型鉴定

胃癌患者外周血来源巨噬细胞CD204+细胞比例明显高于健康对照组，见图2A。与健康对照组相比，胃癌患者外周血来源巨噬细胞中CD163、CD204、CD206、IL-10和CCL-22的表达水平明显升高，IL-23 (p19)的表达水平明显降低，具有被诱导分化为M2亚型的特性，见图2B。

A：癌组织及癌旁组织巨噬细胞中CD204+细胞比例；B：癌组织及癌旁组织巨噬细胞中M1/M2亚型相关基因表达水平；P：患者；T：癌组织；N：癌旁组织；*:P<0.05，**:P<0.01。

2.3 M2亚型GC-TAMs对胃癌细胞迁移的影响

Transwell迁移实验结果显示，与癌旁组织来源巨噬细胞相比，GC-TAMs可明显促进细胞的体外迁移，差异有统计学意义(P=0.004)。与对照组相比，GC-MSCs显示出较强的促胃癌细胞迁移的作用，差异有统计学意义(P=0.007)，GC-TAMs对胃癌细胞迁移的诱导作用与GC-MSCs相比更强，差异有统计学意义(P=0.009)，见图3。

2.4 M2亚型GC-TAMs对胃癌细胞EMT的影响

GC-TAM-CM组胞体伸缩拉长、细胞间分散程度增加，其间质样细胞形态改变程度比GC-MSC-CM组更强，而GC-Mac-CM组未发生明显改变，见图4。

A：胃癌患者外周血来源巨噬细胞中CD204+细胞比例；B：胃癌患者外周血来源巨噬细胞中M1/M2亚型相关基因表达水平；Ctrl：健康对照组；P：患者；rhIL-4：阳性对照；*：P<0.05，**：P<0.01。

图2 胃癌患者外周血来源巨噬细胞亚型鉴定

**：P<0.01。

图4 各组细胞镜下形态

2.5 GC-TAMs对胃癌细胞EMT相关蛋白和基因表达的影响

Western blot检测结果显示，与对照组比较，GC-TAM-CM组细胞EMT相关蛋白fibronectin、vimentin和snail2的表达明显上调(P<0.05)，GC-TAM-CM组细胞EMT相关蛋白fibronectin、snail2表达明显高于GC-MSC-CM组(P<0.05)，见图5。RT-qPCR检测结果显示，与对照组相比，GC-TAM-CM组细胞EMT相关基因fibronectin、vimentin和snail2的表达明显上调，而E-cadherin表达则明显下调，差异有统计学意义(P<0.05)；GC-TAM-CM组细胞EMT相关基因fibronectin、vimentin表达明显高于GC-MSC-CM组(P<0.05)，见图6。

*：P<0.05，**：P<0.01。

*：P<0.05，**：P<0.01。

3 讨 论

目前，转移与复发仍然是胃癌患者病死率居高不下的主要原因[8]。研究证实，胃癌微环境中大量存在的诸如血管内皮生长因子 (vascular endothelial growth factor,VEGF)、金属基质蛋白酶在内的分泌因子及信号通路效应分子等均具有促进肿瘤转移基质形成和肿瘤细胞远端器官转移的作用[9]。胃癌细胞与微环境基质细胞之间的相互作用参与了胃癌转移的一系列关键步骤，包括EMT、血管内渗、循环肿瘤细胞迁移和次级器官转移等[10]，其有望成为临床胃癌转移患者靶向治疗的重要靶点。

作为肿瘤微环境中浸润数量最多的炎症细胞，TAMs在肿瘤基质重塑、血管生成和化疗抵抗等肿瘤病理学进展的多个环节均有重要作用[11]。通过大量分泌细胞因子、趋化因子等，TAMs为肿瘤生长及转移“创造”免疫抑制微环境，是调节胃癌转移的重要微环境基质细胞之一[12]。

本研究发现，GC-TAMs中CD204+细胞比例明显高于癌旁组织来源巨噬细胞。同时，GC-TAMs中CD163、CD204和CD206等M2亚型相关基因的表达水平也明显高于癌旁组织来源巨噬细胞。提示胃癌微环境中浸润的TAMs以具有促肿瘤作用的M2亚型为主。同时，胃癌患者外周血来源巨噬细胞的亚型特性与健康对照组也存在明显差异，胃癌患者外周血单核细胞更“倾向于”极化为M2亚型巨噬细胞。

有研究指出，肺癌细胞可诱导巨噬细胞极化为M2亚型，而其又对肺癌细胞的侵袭、迁移及EMT发挥促进作用[13]。另有研究者在神经母细胞瘤中证实，TAMs对肿瘤细胞增殖能力并无影响，但可通过CXCL2/CXCR2信号通路明显促进肿瘤细胞侵袭[14]。本研究发现，M2亚型GC-TAMs可促进胃癌细胞迁移，该促进作用比早期文献报道的GC-MSCs更强。提示胃癌微环境中浸润的M2亚型巨噬细胞可能在胃癌转移中发挥重要作用。

作为肿瘤转移的显著特征之一，EMT往往伴随一系列细胞与分子生物学改变，包括：细胞-细胞间黏附性降低、细胞形态发生长梭样改变及间质样蛋白的表达上调[15]。本研究观察到胃癌细胞在GC-TAMs的处理下发生了细胞形态学改变。与对照组相比，GC-TAM-CM组胃癌细胞的形态更加细长，细胞间更加散在分布，且该间质样形态改变与GC-MSC-CM组相比更为明显。有研究报道，M2亚型TAMs可部分通过TLR-4/IL-10信号通路促进胰腺癌细胞EMT[16]。另一篇基于卵巢癌的报道指出，肿瘤组织中大量浸润的TAMs可通过表达EMT驱动因子ZEB1而发挥其促肿瘤及化疗抵抗作用[17]。此外，胃癌组织中TAMs的大量浸润提示患者预后不良，且可通过TGF-β信号通路参与诱导肿瘤EMT[18]。本研究显示，GC-TAMs可明显上调胃癌细胞中间质样基因vimentin、fibronectin和snail2的表达水平。由此证实，胃癌组织中浸润的M2亚型TAMs可有效促进胃癌细胞发生EMT。

此外，本研究还存在着一定的局限性，如纳入研究的胃癌患者病例数较少，且GC-TAMs促进胃癌转移的相关研究尚缺乏动物体内实验，这都值得进一步深入研究。

肿瘤微环境细胞通过细胞间相互作用及分泌细胞因子、趋化因子等形式作用于肿瘤细胞，从而对肿瘤发生、发展及耐药等发挥重要调节作用[19-20]。本研究证实，胃癌微环境中浸润着大量M2亚型TAMs，该细胞通过诱导胃癌细胞发生EMT而对胃癌转移发挥促进作用。