和厚朴酚通过上调TRAF3表达对类风湿关节炎滑膜细胞活化的影响*

吕昌伟，和 晶，张 乾，郗海涛，强 毅，张静涛

(西北大学附属医院/西安市第三医院骨科，西安 710018)

类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种炎性自身免疫性疾病，病程长、预后差、致残率高，严重影响患者生活质量[1]。然而，RA的发病机制目前仍不完全清楚，尚无有效的根治方法。类风湿关节炎滑膜细胞(fibroblast-like synoviocyte，FLS)在RA的病理发展中起到了重要作用[2]。研究表明，FLS的异常增生和活化，是导致RA患者滑膜增生、滑膜炎症和软骨损伤的重要原因[3-5]。活化的FLS发生过度增殖，并通过产生大量炎症因子和基质金属蛋白酶(matrix met alloproteinase，MMP)，如肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-6、IL-8、CXC趋化因子配体10(CXCL10)、MMP-2和MMP-9，募集和激活免疫细胞和关节细胞，触发并维持关节的慢性炎症和进行性损坏[6]。

和厚朴酚(honokiol，HNK)是木兰科植物厚朴中提取的主要药效成分之一，具有抗炎、镇痛、抗氧化、免疫调节等作用[7-8]。虽然治疗RA的中医验方中使用了厚朴[9]，但目前并无NHK对RA治疗的研究。本研究探讨HNK通过上调肿瘤坏死因子受体相关因子3(TRAF3)表达对FLS活化的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

MH7A细胞株(日本Riken cell bank公司)；1%青链霉素、CCK-8试剂盒(碧云天生物科技有限公司)；人重组TNF-α(BBI生命科学有限公司);RNAiso Plus、PrimeScriptRT Master Mix试剂盒、TB Green Premix Ex Taq Ⅱ试剂盒(日本TaKaRa公司)；细胞外调节激酶(ERK)抑制剂MK-8353(MK)、HNK(美国MCE公司)；si-TRAF3(美国Santa Cruz公司)；人IL-6、CXCL10 ELISA检测试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)；lipofectamin 2000、optiMEM(美国Invitrogen公司)；酶标仪(瑞士Tecan公司)。

1.2 方法

1.2.1细胞培养及分组

MH7A细胞株采用RPMI-1640培养基添加10%胎牛血清和1%青链霉素培养。对照(CON)组无处理，TNF-α(TNF)组采用5 ng/mL TNF-α处理24 h，TNF+HNK组、TNF+HNK+MK组、TNF+HNK+siTRAF3组分别采用5 ng/mL TNF-α分别复合10 μmol/L HNK、1 μmol/L MK或si-TRAF3干扰处理24 h，同时设立二甲亚砜(DMSO)溶剂对照。

1.2.2siRNA转染

将si-TRAF3和si-CON同lipofectamin 2000溶解于optiMEM，室温稳定20 min制成转染液。细胞用转染液培养6 h，换回正常培养基，用于后续实验。

1.2.3CCK-8检测细胞活力

各组处理细胞结束后，采用CCK-8试剂盒检测细胞增殖。用正常培养基按照1∶9体积配制CCK-8溶液，每孔加入100 μL CCK-8溶液，37 ℃孵育1 h，于酶标仪测定450 nm吸光度。

1.2.4ELISA检测IL-6、CXCL10表达

收取细胞培养上清液，采用人IL-6、CXCL10 ELISA检测试剂盒，按照产品说明书，进行操作和检测。

1.2.5Real-time PCR检测TRAF3 mRNA表达

采用RNAiso Plus提取细胞总RNA，PrimeScriptRTMaster Mix试剂盒将RNA逆转录为cDNA，采用TB Green Premix Ex Taq Ⅱ试剂盒进行Real-time PCR检测，引物序列如下：TRAF3:forward 5′-ACA TCC GCC TAG CCG ACA TGG-3′，reverse 5′-CTG CTT CCG CCG CTT GTA GTC-3′；GAPDH：forward 5′-AGG TCG GTG TGA ACGGAT T-3′，reverse 5′-AAT CTC CAC TTT GCC ACT GC-3′，于CFX96 Real-Time System上机检测。全部操作按照使用说明书进行。

1.2.6Western blot检测TRAF3、MMP-2、MMP-9、p-ERK蛋白表达

RIPA裂解液收集细胞蛋白，BCA试剂盒测定蛋白浓度，加入4×Laemmli缓冲液，97 ℃加热10 min。10% SDS-PAGE凝胶电泳，250 mA转至PVDF膜。分别孵育TRAF3一抗、MMP-2一抗、MMP-9一抗、ERK一抗、p-ERK一抗、β-actin一抗，4 ℃过夜，室温孵育羊抗兔二抗。化学发光后，置于ChemiDoc XRS+凝胶成像系统检测。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 HNK对MH7A细胞活化的影响

与CON组比较，TNF组细胞IL-6、CXCL10分泌明显增加(P<0.05)，MMP-2和MMP-9蛋白表达明显升高(P<0.05)。TNF+HNK组细胞活力较CON组和TNF组明显降低，且IL-6、CXCL10分泌和MMP-2、MMP-9蛋白表达较TNF组明显降低(P<0.05)，见图1。

2.2 HNK对MH7A细胞TRAF3表达的影响

与CON组和TNF组比较，TNF+HNK组TRAF3 mRNA和蛋白表达明显升高(P<0.05)，见图2。

2.3 TRAF3介导HNK对MH7A细胞活化的影响

与si-CON组比较，si-TRAF3组TRAF3蛋白表达明显降低(P<0.05)。TNF+HNK+siTRAF3组IL-6、CXCL10分泌和MMP-2、MMP-9蛋白表达较TNF+HNK组明显升高(P<0.05)，见图3。

2.4 ERK信号通路在HNK调控TRAF3表达中的作用

与CON组和TNF组比较，TNF+HNK组p-ERK1/2蛋白表达明显升高(P<0.05)，TNF+HNK+MK组p-ERK1/2、TRAF3蛋白表达明显低于TNF+HNK组(P<0.05)，见图4。

A：各组MH7A细胞增殖情况；B：各组细胞IL-6水平；C：各组细胞CXCL10水平；D：各组细胞MMP-2和MMP-9蛋白印迹图；E：各组细胞MMP-2蛋白表达；F：各组细胞MMP-9蛋白表达；*：P<0.05，**：P<0.01，与CON组比较；#：P<0.05，##：P<0.01，与TNF组比较。

A：各组细胞TRAF3 mRNA表达；B：各组细胞TRAF3蛋白印迹图；C：各组细胞TRAF3蛋白表达；*：P<0.05，**：P<0.01，与CON组比较；#：P<0.05，##：P<0.01，与TNF组比较。

A：各组细胞TRAF3蛋白表达；B：各组细胞IL-6水平；C：各组细胞CXCL10水平；D：各组细胞MMP-2和MMP-9蛋白印迹图；E：各组细胞MMP-2蛋白表达；F：各组细胞MMP-9蛋白表达；*：P<0.05，**：P<0.01，与CON组比较；#：P<0.05，##：P<0.01，与TNF组比较；&：P<0.05，与TNF+HNK组比较。

A：各组细胞p-ERK1/2、ERK1/2、TRAF3蛋白印迹图；B：各组细胞p-ERK1/2蛋白表达；C：各组细胞TRAF3蛋白表达；**：P<0.01，与TNF组比较；#：P<0.05，##：P<0.01，与TNF+HNK组比较。

3 讨 论

目前，临床治疗RA的主要药物包括糖皮质激素和非甾体消炎药，以及甲氨蝶呤等，而这些药物往往不能实际缓解病情[10]。中药用于RA治疗具有悠久的历史并多能缓解病情进展[11]。中药厚朴在治疗RA的中药复方中亦被广泛配伍使用[9]，其中HNK是厚朴中主要有效成分之一，具有广泛的抗炎活性[12]。FLS的异常活化在RA的发病中发挥了关键作用[13-14]。本研究显示，HNK可明显抑制FLS的增殖，并抑制了TNF-α所致的促炎因子IL-6、CXCL10的分泌，以及MMP-2和MMP-9蛋白表达。提示HNK可有效抑制FLS活化，降低FLS增殖、炎性反应和侵袭能力，其具有治疗RA的潜在价值。

已有研究显示，HNK可通过阻断核因子(NF)-κB信号通路抑制炎性反应，降低IL-6和MMP-9的表达[15]。但是，HNK抑制NF-κB信号通路激活的机制并不清楚。TRAF3作为细胞内一种重要的负性炎症调控因子，其高表达可有效阻止NF-κB信号的激活[6,16]。NF-κB信号的激活可促进FLS的异常活化[6]，诱发IL-6、MMP-2、MMP-9和CXCL10表达升高[17-19]。本研究显示，HNK可上调TRAF3蛋白表达。因此，HNK可能通过上调TRAF3表达，抑制NF-κB激活，进而抑制FLS活化。这些结果也与先前的研究一致，即TRAF3和NF-κB与细胞增殖、迁移、侵袭和炎性反应相关[6,20-21]。

HNK已在多个细胞内被证明可以激活ERK1/2信号抑制细胞迁移，并引起细胞自噬和凋亡[22-23]。但HNK是否能通过激活ERK1/2信号，进而上调TRAF3表达尚不清楚。本研究结果表明， ERK1/2信号激活介导了HNK对TRAF3表达的上调作用。前期有研究报道miRNA-17-92靶向干扰TRAF3翻译表达，引起了细胞迁移和侵袭能力的增强，并且导致了ERK信号的激活[24]，表明ERK信号和TRAF3之间可能存在双向作用。

目前，RA的临床治疗仍面临诸多问题。本研究提示了中药厚朴成分HNK对RA的潜在治疗价值,对降低目前临床药物用量，减少并发症提供了一种可能途径。