篱栏网多糖的提取工艺优化及抗氧化活性

陈淑芳，黎庆涛，黄凯，邬智高，张文清，张良军

(1.广西大学 轻工与食品工程学院，广西 南宁 530004；2.广西工业职业技术学院 医药健康学院，广西 南宁 530004)

篱栏网[Merremiahederacea(Burm.f.)Hall.f.]为旋花科鱼黄草属植物,近年来研究人员发现篱栏网中可能含有多糖、苷类、黄酮等化学成分，具有抑菌[1]、消炎[2]、提高机体吞噬细胞数量[3]等作用。目前，多见对篱栏网粗提取物生物活性的研究，其有效活性成分还并不明确。

现已有大量研究报道多糖具有抗氧化[4]、抗衰老[5]、免疫调节[6]等一系列重要的生物活性，多糖已经被广泛用于食品、医药、农业和化妆品工业中。

本文对篱栏网多糖的热水浸提工艺进行优化，并测定其对两种自由基的清除能力，为后续天然抗氧化剂的开发及篱栏网的综合利用奠定基础。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

篱栏网采集于广西南宁，由广西卫生职业技术学院钟珍副教授鉴定为篱栏网[Merremiahederacea(Burm.f.)Hall.f.]的全草；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、浓硫酸、苯酚、硫酸亚铁、水杨酸、L(+)-抗坏血酸等均为分析纯。

HH-S26恒温水浴锅；SHZ-Ⅲ循环水式多用真空泵；RE-2010旋转蒸发器；TU-1950分光光度计。

1.2 篱栏网多糖的提取

篱栏网，清洗除杂，烘干，粉碎过60目筛。乙醇预处理，烘干。热水浸提，液料比25 mL/g，提取温度90 ℃，提取时间3.5 h，提取次数2次。收集上清液，抽滤，旋蒸，醇沉过夜。收集沉淀，冻干，沉淀复溶，得篱栏网粗多糖水溶液，采用分光光度计测定多糖含量，计算篱栏网多糖得率(Y)。

Y=[(c标曲对应浓度·V多糖溶液)/M原料质量]×100%

(1)

1.3 葡萄糖标准曲线的绘制[7]

葡萄糖浓度与吸光度值的标准曲线见图1。

图1 葡萄糖标准曲线Fig.1 Standard curve of glucose

1.4 篱栏网多糖的抗氧化作用

1.4.1 清除DPPH 自由基能力的测定 清除 DPPH自由基能力的测定按照参考文献[4]的方法，由公式(2)计算：

Y=[(A0-A样品+A样品空白)/A0]×100%

(2)

1.4.2 清除羟自由基能力的测定 清除羟自由基能力的测定按照参考文献[4]的方法，由公式(3)计算。

Y=[(A0-A样品+A样品空白)/A0]×100%

(3)

2 结果与讨论

2.1 单因素实验

每组测定3次。

2.1.1 提取次数对篱栏网多糖得率的影响 提取次数的影响见图2。

图2 提取次数对篱栏网多糖得率的影响Fig.2 Effects of extraction times on yield of Merremiahederacea polysaccharides

由图2可知，篱栏网多糖得率随着提取次数的增加而增加，可能是因为多糖提取存在溶出平衡，加入新鲜的溶剂会重新建立平衡，促使更多多糖溶出，提取次数为2次时，篱栏网多糖已基本提取完毕，所以第3次提取时没有更多多糖溶出。确定提取次数为2次。

2.1.2 液料比对篱栏网多糖得率的影响 液料比的影响见图3。

图3 液料比对篱栏网多糖得率的影响Fig.3 Effects of ratio of liquid to material on yield ofMerremia hederacea polysaccharides

由图3可知，篱栏网多糖得率随着液料比的增加呈现先升高后下降的趋势，液料比为25 mL/g时，篱栏网得率最大。这可能是由于随着液料比增大，篱栏网植物细胞与水之间的浓度差异大，有利于多糖溶出，但液料比过大可能会降低分子之间的相互作用，还会导致篱栏网中部分水溶性杂质溶出，干扰多糖溶出效果。选择液料比为25 mL/g。

2.1.3 温度对篱栏网多糖得率的影响 提取温度的影响见图4。

图4 温度对篱栏网多糖得率的影响Fig.4 Effects of temperature on yield of Merremiahederacea polysaccharides

由图4可知，篱栏网多糖得率随着温度的升高先增加后降低，90 ℃时达最高。可能是温度增加，改善了篱栏网多糖的溶解性，100 ℃时，得率略有下降，可能是篱栏网多糖的碳链对热降解敏感，多糖发生变性降解，降低了提取过程中靶向回收率。考虑到温度越高，能耗越高，选择提取温度为90 ℃。

2.1.4 提取时间对篱栏网多糖得率的影响 提取时间的影响见图5。

由图5可知，篱栏网多糖得率随时间的变化规律基本符合菲克第二定律：在一定时间后，固体基质和萃取溶液中的溶质浓度会达到平衡。提取时间到达3.5 h时，多糖得率已趋于稳定，再增加反应时间对多糖得率影响不大。提取时间选择3.5 h。

图5 提取时间对篱栏网多糖得率的影响Fig.5 Effects of extraction time on yield of Merremiahederacea polysaccharides

2.2 响应面优化实验

2.2.1 响应面实验结果 选择液料比、温度和提取时间为自变量，通过响应面实验优化篱栏网多糖的提取工艺，因素水平见表1，结果见表2。

表1 响应曲面因素水平表Table 1 The factors and levels of response surface

表2 响应面实验结果Table 2 Experimental design and results forresponse surface analysis

用Design-Expert8.0.6软件对表2数据进行拟合，得到篱栏网多糖得率(Y)对液料比(A)、温度(B)和提取时间(C)的回归模型Y=4.31+0.15A+0.31B+0.25C-0.083AB+0.017AC-0.18BC-0.39A2-0.25B2-0.21C2，方差分析结果见表3。

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

由表3可知，回归模型的P值<0.000 1，差异显著。失拟项的值为0.415 6，高于0.05，相对于纯误差而言不显著。说明该模型可以用来分析篱栏网多糖的提取工艺。

2.2.2 响应面交互作用分析 使用Design-Expert8.0.6软件绘制响应值与不同影响因子间的响应面及等高线图，见图6(a～c)。

由图6a可知，在料液比20～30 mL/g的范围内，随温度从80 ℃增加到95 ℃左右，多糖得率增加，而后随温度从95 ℃增加至100 ℃，多糖得率变化不大。由图6b可知，温度为80～100 ℃时，随提取时间由3 h升至4 h，多糖得率增加，在4 h后多糖提取达平衡，得率变化不大。由图6c可知，在提取时间在3～4 h范围内时，多糖得率随料液比增大先升高后降低。

图6 各因素交互作用对篱栏网多糖得率的响应面及等高线图Fig.6 Response surface diagrams and contour diagrams of the interactive effects of variousfactors on the yield of Merremia hederacea polysaccharides

据报道[8]，溶解率是提取过程中的限速步骤，提取温度对多糖的溶解率具有重要影响。因此，温度是热水提取法提取篱栏网多糖的关键因素。通常热水提取法提取植物多糖的最适温度在90 ℃左右，不同文献中报道的温度范围略有不同，具体取决于提取物和提取的方法。

回归方程预测篱栏网多糖最佳提取工艺条件为：液料比25.59 mL/g，温度 94.5 ℃，提取时间 3.6 h，最大篱栏网多糖得率为 4.39%。

2.2.3 验证实验 为便于实际操作，将最佳条件简化为：液料比26 mL/g，温度94.5 ℃，提取时间 3.6 h，在该条件下提取2次，实际篱栏网多糖得率为(4.38±0.04)%，与预测值4.39%相近。因此，该模型预测的篱栏网多糖提取工艺参数是可行的。

2.3 抗氧化能力分析

多糖的抗氧化性归因于多糖链上的电子供体或氢供体官能团，可以通过进行体外抗氧化剂测定。

2.3.1 DPPH自由基清除能力 DPPH自由基具有不成对的电子，呈紫色，当其遇到自由基清除剂后会被还原而转变为黄色。由图7可知，篱栏网多糖清除DPPH自由基的IC50为(0.12±0.03)mg/mL。

图7 篱栏网多糖对DPPH自由基清除能力Fig.7 Scavenging ability of Merremia hederaceapolysaccharides to DPPH free radical

2.3.2 羟自由基清除能力 羟自由基是自然界危害最大的反应性自由基之一，它可以与细胞中几乎所有的生物大分子发生反应，清除该自由基对于预防氧化损伤至关重要。由图8可知，篱栏网多糖对羟自由基的清除率与抗坏血酸相近，其IC50值为 (1.21±0.02)mg/mL。

图8 篱栏网多糖对羟自由基清除能力Fig.8 Scavening ability of Merremia hederaceapolysaccharides to hydroxy free radical

3 结论

采用热水浸提法提取篱栏网多糖最佳工艺参数为：液料比26 mL/g，温度94.5 ℃，提取时间3.6 h。在此条件下，篱栏网多糖得率为(4.38±0.04)%。该多糖具有较好的抗氧化能力，可用于食品，药物和医学应用。