ALDH1 在乳腺癌及乳腺癌癌旁组织中的表达及临床病理意义

余丽颖，詹欣雨，曾思羽，陈明付，高 欢，陈琼霞，陈 莹，镇鸿燕

（江汉大学 医学院，湖北 武汉 430056）

肿瘤干细胞（cancer stem cell，CSC）是一群具有自我更新能力和分化潜能的细胞，可导致多种恶性肿瘤生物学行为，如复发、转移、异质性、多药耐药、放疗耐药等［1］。肿瘤干细胞标记物对于肿瘤诊断、治疗及预后判断具有重要意义。

2018 年国际癌症研究机构（International Agency for Research on Cancer）发布全球癌症发病率和死亡率评估值表明，乳腺癌在全球女性癌症发生率和死亡率均位居首位［2］，是严重危害女性健康的疾病。2003 年Al－Hajj 等［3］研究发现CD44＋CD－/lowLineage－标记的乳腺癌细胞具有干细胞的特性，是最早被鉴定出来的乳腺癌干细胞。乳腺癌干细胞被认为是许多乳腺癌患者复发及转移的“元凶”，乳腺癌的发生、发展、转移及耐药与肿瘤干细胞密切相关，影响乳腺癌患者的生存及预后，一些相关肿瘤标记物可以用于乳腺癌靶向性治疗及预后判断［4－7］。

乙醛脱氢酶1（aldehyde dehydrogenase 1，ALDH1）是乙醛脱氢酶家族成员之一，是一种解毒酶，负责将视黄醇氧化为视黄酸［8］。研究［9－13］表明，ALDH1 是结肠癌、肺癌、胰腺癌、膀胱癌等多种肿瘤干细胞标记物。2007 年，Ginestier 等首次鉴定ALDH1 是乳腺癌的干细胞标志物［14］。该研究表明ALDH1 蛋白表达阳性的乳腺癌细胞表现出肿瘤干细胞的特性，具有成瘤性。但目前ALDH1 在乳腺癌免疫组化定位研究及临床病理相关性研究国内相关报道较少，尚待进一步开展。

本研究拟采用免疫组织化学方法检测ALDH1 蛋白在乳腺癌及癌旁组织中的定位及表达情况，并结合临床病理资料分析ALDH1 与乳腺癌T 分期肿瘤最大直径、肿瘤分级及淋巴结转移的关系，以期对乳腺癌的诊断和预后判断提供依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象

收集2008－2013 年江大病理诊断所确诊为乳腺癌的病例71 例，全部病例手术前均未进行放疗和化疗。全部病例均为女性病人，年龄27 ～88 岁，中位年龄58 岁。腋窝淋巴结清扫病例48例，其中淋巴结转移38 例。组织学分级：I 级4 例，II 级49 例，III 级18 例。根据肿瘤T 分期将肿瘤分成：T1 ～T2 期即肿瘤最大直径为0 ～5 cm 54 例，T3 期即肿瘤最大直径≥5 cm 17 例。71例肿瘤患者中癌旁组织29 例。所有标本均用10%中性甲醛固定，石蜡包埋。由有经验的病理医生进行HE 病理切片的复查和筛选，在HE 切片中标记并选取典型的乳腺癌组织及其癌旁组织，取直径1 mm 的组织芯制成组织微阵列芯片。

1.2 免疫组织化学检测

鼠抗人单克隆ALDH1 为美国BD 公司产品，Envision 试剂盒为丹麦Dako 公司产品，ALDH1一抗工作浓度1∶100。组织切片常规脱蜡水化，微波修复煮沸10 min。染色方法采用Envision 二步法，用PBS 代替一抗作为阴性对照。一抗孵育4 ℃过夜。

1.3 ALDH1 免疫组化染色结果判定

细胞质或细胞核着色，呈现明确的棕黄色颗粒，且定位准确、背景清晰。参照许良中等［15］免疫组化评分标准首先按染色强度打分：0 分为无色，1 分为淡黄色，2 分为棕黄色，3 分为棕褐色（染色深浅须与背景对照）；再按阳性细胞所占的百分比打分：0 分为阴性，1 分为阳性细胞数≤10%，2 分为阳性细胞数为11% ～50%，3 分为阳性细胞数为51% ～75%，4 分为阳性细胞数为≥75%。染色强度与阳性细胞百分比的乘积＞3 分为免疫反应（＋），0 ～2 分为阴性。

1.4 统计学分析

统计学处理采用SPSS20 软件进行数据分析，肿瘤T 分期（肿瘤最大径）、肿瘤分级及淋巴结转移组间阳性率差异用χ2检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ALDH1 在乳腺癌及癌旁组织中表达情况

29 例乳腺癌癌旁导管组织中，ALDH1 表达主要呈核表达。癌旁正常乳腺导管组织，ALDH1表达主要定位导管肌上皮细胞内呈散在分布，少许定位在导管上皮内呈散在分布（图1）；癌旁组织部分导管中见乳腺导管上皮增生，在增生上皮内见ALDH1 阳性表达细胞（图2）；71 例乳腺癌中，ALDH1 表达主要定位于细胞浆中，部分癌组织呈散在表达（图3），部分癌组织呈弥漫表达，表达细胞呈星芒状结构（图4）。

图1 正常乳腺导管中ALDH1 表达（Envision 法20×）Fig.1 Expression of ALDH1 in normal mammary ducts（Envision 20×）

图2 乳腺增生导管中ALDH1 表达（Envision 法20×）Fig.2 Expression of ALDH1 in the duct of mammary hyperplasia（Envision 20×）

图3 乳腺癌中ALDH1 散在表达（Envision 法40×）Fig.3 Scattered expression of ALDH1 in breast cancer（Envision 40×）

图4 乳腺癌中ALDH1 弥漫表达（Envision 法40×）Fig.4 Diffused expression of ALDH1 in breast cancer（Envision 40×）

2.2 ALDH1 在乳腺癌中的表达与临床病理特征的关系

71 例乳腺癌中ALDH1 阳性表达32 例，阳性率45.1%。T1 ～T2 期54 例肿瘤中ALDH1 表达阳性28 例，阳性率51.9%；T3 期肿瘤17 例中ALDH1 表达阳性4 例，阳性率23.5%。组织学分级I 级肿瘤4 例中ALDH1 表达阳性3 例，阳性率75.0%；II 级肿瘤49 例中ALDH1 表达阳性19例，阳性率38.8%；III 级肿瘤18 例中ALDH1 表达阳性10 例，阳性率55.6%。腋窝淋巴结转移肿瘤38 例中ALDH1 表达阳性16 例，阳性率42.1%；腋窝淋巴结无转移肿瘤10 例中ALDH1 表达阳性3 例，阳性率30.0%。ALDH1 表达与乳腺癌患者T 分期、肿瘤分级及淋巴结转移统计学无显著相关关系（P＞0.05）（表1）。

表1 ALDH1 的表达与乳腺癌临床病理参数之间的关系（n＝71）Tab.1 Relationship between ALDH1 expression and clinicopathological parameters of breast cancer（n＝71）

3 讨论

研究［16］表明，肿瘤干细胞与肿瘤发生、异质化及转移密切相关。1994 年，Dick 团队成功鉴定人急性髓系白血病细胞成瘤细胞是CD34＋CD38－细胞［17］，首次证明肿瘤干细胞存在。Al－Hajj等［3］2003 年从乳腺癌中分离具有干细胞特性的CD44＋/CD24－/low细胞表型的细胞，并证实乳腺癌中存在一种具有成瘤能力的肿瘤干细胞，即乳腺癌症干细胞。目前，研究证明，乳腺癌的肿瘤干细胞标记物有许多种，如CD133、CD44、CD24、ALDH1 等，其中ALDH1 是非常重要的肿瘤干细胞标记物。

乙醛脱氢酶（aldehyde dehydrogenase，ALDH）家族中共包括了17 种同工酶，广泛分布于多种组织中，能够催化多种醛的氧化［18］。哺乳动物乙醛脱氢酶根据其亚细胞所在位置、结构与动力学特性和原始序列的相似性可以分为三类：第一类是细胞质的乙醛脱氢酶（ALDHl）；第二类是线粒体的乙醛脱氢酶（ALDH2）；第三类则是可诱导性的细胞质的乙醛脱氢酶和可诱导性的微粒体的乙醛脱氢酶（ALDH3）［19］。

乙醛脱氢酶1（ALDH1）能有效促使短链脂肪族醛和芳香族醛的氧化，是一种催化一系列脂肪族和芳香族醛氧化成相应的羧酸的酶，它几乎存在于所有哺乳动物组织。人类ALDH1 基因位于9 号染色体，由5.3 × 104个碱基对构成，包含13 个外显子，共编码501 个氨基酸［20］。ALDH1是一种含锌酶类，由两个亚基组成，其中一个位于酶的活性中心，另一个起着稳定四级结构的作用。ALDH1 具有高度氧化活性，在氧化视黄醇为视黄酸的过程中参与基因的表达和细胞增殖、分化。因此，探讨ALDH1 蛋白表达定位及临床病理关系，有助于了解乳腺癌干细胞在乳腺癌发生及侵袭转移中的作用，为乳腺癌患者治疗提供潜在靶点。

Ginestier 等［14］对577 份乳腺癌患者癌组织标本行免疫组化检测研究，发现高表达ALDH1 的乳腺癌细胞具有干细胞特性，并与乳腺癌患者生存期有显著相关性。

本研究发现，ALDH1 在乳腺癌中的表达率为45.1%，与Mansour 等［16］的研究结果41.7%接近。图1 ～图3 显示，乳腺癌组织同良性乳腺组织相比，阳性细胞数量明显增多，证明了乳腺癌癌症干细胞含量增多，乙醛脱氢酶在乳腺癌干细胞中活性明显升高。因此，在乳腺癌与乳腺良性病变中，ALDH1 的阳性表达定位差异可以作为判断肿瘤良恶性的辅助标记。

此外，乳腺癌旁组织中，ALDH1 主要表达在细胞核中，而乳腺癌组织中则主要表达在细胞质中，这说明在肿瘤的发生中，ALDH1 出现了从细胞核到细胞质的转位。乙醛脱氢酶是一类存在于细胞质的酶类。ALDH1 核表达可能是其沉默状态，当肿瘤干细胞被激活，处于活跃增殖状态时，ALDH1 则进入细胞质内行使其功能。因此，ALDH1 可能是肿瘤干细胞生长活跃的标志，这有待进一步研究。

同时，本研究发现，不同T 分期肿瘤ALDH1 的表达率不同，其中T1 ～T2 期肿瘤ALDH1 表达率51.9%，T3 期为23.5%，前者ALDH1 阳性率明显高于后者。该研究结果提示肿块较小的肿瘤中可能存在相对比例较高的ALDH1 阳性肿瘤干细胞，因此，小体积肿瘤具有生长迅速的潜能。

Armstrong 等［21］的研究表明ALDH1 通过参与视黄醇的氧化过程参与基因的表达和组织分化，是造血干细胞分化的关键调节因子。本研究结果表明，组织学分级I 级及III 级ALDH1 阳性率分别为75.0%、55.6%，前者明显高于后者。同时，图1 与图3 显示在良性组织中ALDH1 阳性细胞呈核表达，癌组织中呈星芒状，因此，提示在ALDH1 阳性乳腺癌细胞在肿瘤形成中出现了上皮间质化改变，从而在形态学角度上证明ALDH1 蛋白表达参与肿瘤细胞分化过程，并证明ALDH1 阳性乳腺癌细胞具有肿瘤干细胞特性。该研究结果与Vieira 等［22］2020 年在头颈癌中的研究结果一致。

另外，本研究结果表明，在淋巴结转移清扫病例中，淋巴结转移与无转移乳腺癌中ALDH1阳性率分别为42.1%及30.0%，淋巴结转移乳腺癌ALDH1 阳性表达呈升高趋势。本研究结果与周飞等［9］2020 年研究结果一致。提示ALDH1 蛋白阳性乳腺癌具有较强侵袭性，与乳腺癌的不良预后密切相关。

综上，本研究结果表明ALDH1 在乳腺癌中表达与肿瘤活跃生长密切相关，同时也与肿瘤形成上皮间质化相关。提示ALDH1 有可能参与肿瘤增殖、分化及转移过程，与乳腺癌的生存及预后密切相关。ALDH1 阳性表达有望成为肿瘤诊断及治疗的靶点。