不同类型哮喘患者外周血ILC2s变化及其临床意义

杨慧，曹丽丽，赵继萍，刘晓菲，潘云，徐嘉蔚，董亮

1 山东大学齐鲁医学院，济南250012；2 山东省千佛山医院呼吸与危重症医学科；3 临沂市人民医院呼吸与危重症医学科；4 山东大学齐鲁医院呼吸与危重症医学科

支气管哮喘(简称哮喘)是一种常见的气道慢性炎症性疾病[1]。一项最新的调查显示，我国20岁及以上人群哮喘的患病率为4.2%[2]，哮喘已经成为严重影响我国居民健康的公共卫生问题之一。气道慢性炎症被认为是哮喘的基本病理改变和反复发作的主要病理生理机制，表现为IL-4、IL-5、IL-13等Th2型细胞因子释放增多以及嗜酸性粒细胞(EOS)浸润、黏液分泌增多和免疫球蛋白E(IgE)产生[3]。近年研究发现，哮喘小鼠2型固有淋巴细胞(ILC2s)显著增多，而ILC2s是Th2型细胞因子的重要来源，能够与Th2型细胞因子共同参与哮喘的发病过程[4-5]。但既往ILC2s与哮喘关系的研究多停留在动物模型实验阶段，相关的临床研究较少。本研究观察了不同类型哮喘患者外周血ILC2s变化，并探讨其临床意义。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2018年11月—2019年9月山东大学齐鲁医院收治的哮喘患者46例。根据抗原特异性IgE(sIgE)水平[1，6-7]分为过敏性哮喘(AA，sIgE≥0.35 kUA/L)21例(AA组)、非过敏性哮喘(NAA，sIgE<0.35 kUA/L)25例(NAA组)，根据外周血EOS计数[2，8]分为嗜酸性粒细胞性哮喘(EA，EOS计数≥0.3×109/L)24例(EA组)、非嗜酸性粒细胞性哮喘(NEA，EOS计数<0.3×109/L)22例(NEA组)。所有哮喘患者符合2018年全球哮喘倡议[7]和我国《支气管哮喘诊治指南》[1]中的诊断标准。纳入标准：①符合哮喘诊断标准；②入组前至少4周未接受过抗哮喘药物治疗，如支气管扩张剂、糖皮质激素、白三烯受体拮抗剂、茶碱类药物等。排除标准：①年龄<18岁或>65岁者；②合并其他肺部疾病者，如支气管扩张症、间质性肺疾病、肺良恶性肿瘤等；③合并心、肝、脑、肾等重要脏器严重疾病者；④合并免疫系统疾病者；⑤妊娠期或哺乳期妇女。AA组男12例、女9例，年龄19～65(43.19±15.09)岁，BMI(23.64±3.49)kg/m2；NAA组男10例、女15例，年龄25～65(47.44±10.42)岁，BMI(25.66±2.86)kg/m2。EA组男10例、女14例，年龄22～65(45.33±12.68)岁，BMI(24.71±3.19)kg/m2；NEA组男12例、女10例，年龄19～65(45.68±13.21)岁，BMI(24.76±3.47)kg/m2。同期随机选取在山东大学齐鲁医院体检健康的志愿者13例(NC组)，均无变应性疾病史或过敏史，近3个月内无感染史或用药史。其中，男4例、女9例，年龄23～65(42.69±13.57)岁，BMI 26.30(23.15，28.20)kg/m2。AA组、NAA组、NC组基本临床资料具有可比性，EA组、NEA组、NC组基本临床资料亦具有可比性。本研究经山东大学齐鲁医院医学伦理委员会批准[批准号：KYLL-2017(KS)-112]，所有研究对象或其家属知情同意并签署书面知情同意书。

1.2 外周血ILC2s检测 采集所有研究对象清晨空腹外周静脉血2 mL，置于含EDTA的真空采血管中。取100 μL于1.5 mL EP管中，加入红细胞裂解液300 μL，充分混匀，冰上静置15 min。4 ℃下450×g离心10 min(离心半径99 mm)，弃上清液，向沉淀中加入红细胞裂解液200 μL，充分混匀。以相同条件再次离心，弃上清液。向沉淀中加入PBS 1 mL重悬，4 ℃下1 300 r/min离心5 min(离心半径99 mm)，弃上清液。向沉淀中加入人Fc受体结合抑制剂20 μL，充分混匀，室温静置15 min。4 ℃下1 300 r/min离心5 min(离心半径99 mm)，弃上清液。向沉淀中加入PBS 1 mL重悬，4 ℃下1 300 r/min离心5 min(离心半径99 mm)，弃上清液。向沉淀中分别加入FITC-Lin抗体20 μL、PE/Cy5-CD127抗体5 μL、PE-CRTH2抗体5 μL和PBS 70 μL，充分混匀，室温避光孵育15 min。取上述混合液100 μL加入PBS 1 mL重悬，4 ℃下1 300 r/min离心5 min(离心半径99 mm)，弃上清液。向所得沉淀中加入PBS 1 mL重悬，重悬液经300目一次性过滤网过滤，将滤出液转移至新的离心管中。2 h内上流式细胞仪检测，分选Lin-CD127+CRTH2+的淋巴细胞并定义为ILC2s[6]，所得数据用FlowJo软件进行分析。

1.3 血清sIgE检测 采集哮喘患者清晨空腹外周静脉血2 mL，4 ℃下3 000 r/min离心10 min(离心半径99 mm)，留取上层血清，采用ELISA法检测血清sIgE。

1.4 血浆总免疫球蛋白E(tIgE)、IL-5、IL-13检测 采集哮喘患者清晨空腹外周静脉血2 mL，置于含EDTA的真空采血管中，4 ℃下5 500 r/min离心15 min(离心半径99 mm)，留取上层血浆。采用ELISA法检测血浆tIgE、IL-5、IL-13。

1.5 EOS检测 采集哮喘患者清晨空腹外周静脉血2 mL，经全自动血细胞分析仪检测EOS数量。

1.6 肺功能检测 哮喘患者入组当日采用肺功能测试仪检测第1秒用力呼气容积占预计值百分比(FEV1%pred)、第1秒用力呼气容积(FEV1)/用力肺活量(FVC)。

2 结果

2.1 AA患者和NAA患者外周血ILC2s变化及其与IL-5、IL-13、sIgE、tIgE水平以及EOS计数、FEV1%pred、FEV1/FVC的关系

2.1.1 三组外周血ILC2s、IL-5、IL-13、sIgE、tIgE水平和EOS计数以及FEV1%pred、FEV1/FVC比较 见表1、2。

表1 三组外周血ILC2s、IL-5、IL-13水平及EOS计数比较

表2 三组外周血sIgE、tIgE水平及FEV1%pred、FEV1/FVC比较

2.1.2 AA患者和NAA患者外周血ILC2s与IL-5、IL-13、sIgE、tIgE以及EOS计数、FEV1%pred、FEV1/FVC的关系 AA患者和NAA患者外周血ILC2s与IL-5(r分别为0.86、0.74)、IL-13(r分别为0.53、0.57)和EOS计数(r分别为0.76、0.84)均呈正相关关系(P均<0.05)，与sIgE(r分别为-0.01、0.10)、tIgE(r分别为-0.12、0.38)和FEV1/FVC(r分别为-0.24、-0.34)均无明显相关性(P均>0.05)。AA患者外周血ILC2s与FEV1%pred无明显相关性(r=-0.30，P>0.05)，而NAA患者外周血ILC2s与FEV1%pred呈负相关关系(r=-0.41，P<0.05)。

2.2 EA患者和NEA患者外周血ILC2s变化及其与IL-5、IL-13、sIgE、tIgE水平以及EOS计数、FEV1%pred、FEV1/FVC的关系

2.2.1 三组外周血ILC2s、IL-5、IL-13、sIgE、tIgE水平和EOS计数以及FEV1%pred、FEV1/FVC比较 见表3、4。

表3 三组外周血ILC2s、IL-5、IL-13水平及EOS计数比较[M(P25，P75)]

表4 三组外周血sIgE、tIgE水平和FEV1%pred、FEV1/FVC比较

2.2.2 EA患者和NEA患者外周血ILC2s与IL-5、IL-13、sIgE、tIgE和EOS计数以及FEV1%pred、FEV1/FVC的关系 EA患者外周血ILC2s与IL-5、IL-13、tIgE和EOS计数均呈正相关关系(r分别为0.67、0.65、0.61、0.70，P均<0.05)，与FEV1%pred呈负相关关系(r=-0.52，P<0.05)，而与sIgE、FEV1/FVC无明显相关性(r分别为0.12、-0.37，P>0.05)。NEA患者外周血ILC2s与IL-5、IL-13、sIgE、tIgE和EOS计数以及FEV1%pred、FEV1/FVC均无明显相关性(r分别为0.39、-0.25、0.28、0.14、0.25、0.22、0.17，P均>0.05)。

3 讨论

近年来，哮喘的发病率和病死率持续上升，已成为全球第二大致死和致残疾病[9]。目前，越来越多学者认为哮喘是一种异质性肺病综合征[10]，根据临床表现和发病机制不同，可分为不同的表型和内型。如根据致病因素不同分为AA、NAA以及自发性哮喘[11]，根据气道主要浸润的炎症细胞不同分为EA和NEA。这种不同的表型或内型，使哮喘的临床表现、严重程度以及对治疗的反应性存在明显差别。

ILC2s是由骨髓造血干细胞分化而来的，最早由MJOSBERG等[12]在健康婴幼儿和成人肠道、肺、外周血中发现的一种CRTH2+lin-CD127+CD45+固有淋巴样细胞，其在IL-2、IL-25、IL-33等刺激下可分泌大量IL-13。有研究报道，哮喘患者诱导痰中ILC2s明显升高[8]。在哮喘小鼠肺泡灌洗液中发现ILC2s明显升高，并证实ILC2s是IL-5、IL-13的重要来源细胞[3,13]。结果提示，ILC2s和Th2型细胞因子在哮喘发病过程中可能发挥重要作用。

AA是指接触花粉、尘螨、过冷空气等过敏原导致Th2型细胞因子(如IL-4、IL-5、IL-13)水平升高，从而引起的一种气道慢性炎症性疾病，早期被认为是一种适应性Th2细胞介导的免疫反应[5]。但HALIM等[14]研究发现，ILC2s与Th2型细胞因子共同介导AA的发病过程，并且即使不依赖于适应性免疫应答，ILC2s仍可诱导IL-5、IL-13产生，提示固有免疫在AA的发病过程中发挥重要作用。NAA通常被认为是由非Th2型免疫反应介导，具有成人迟发性发病的特点。但国外一项研究发现，NAA患者外周血ILC2s显著高于健康志愿者[15]。提示ILC2s可能参与NAA的发病过程。本研究AA患者外周血ILC2s明显高于健康志愿者，并且外周血ILC2s与IL-5、IL-13呈正相关关系，与既往研究[14]结果一致。提示ILC2s可能通过介导Th2型细胞因子IL-5、IL-13产生，参与AA的发病过程。本研究还发现，AA患者外周血IL-13水平较NAA患者和健康志愿者显著升高，而外周血IL-5水平虽然高于健康志愿者，但与NAA患者比较差异无统计学意义。说明IL-13可能在AA的发病过程中具有更为重要的作用。TANG等[16]在非变应性哮喘患者肺泡灌洗液、外周血单核细胞中均发现IL-5水平升高。本研究结果亦发现，NAA患者外周血ILC2s、IL-5水平均高于健康志愿者。提示IL-5可能参与NAA的发病过程。sIgE和tIgE是由B细胞分化成的浆细胞分泌产生的免疫球蛋白。本研究AA患者外周血sIgE、tIgE水平均高于NAA患者，但AA患者和NAA患者外周血sIgE、tIgE水平均与外周血ILC2s无明显相关性，提示ILC2s可能与变应反应无明显关系。本研究结果还发现，AA患者与NAA患者FEV1%pred、FEV1/FVC比较差异均无统计学意义，并且FEV1/FVC与外周血ILC2s无明显相关性，AA患者外周血ILC2s与FEV1%pred无明显相关性，而NAA患者外周血ILC2s与FEV1%pred呈负相关关系。我国《支气管哮喘诊治指南》将哮喘分为间歇状态、轻度持续、中度持续、重度持续4级，而FEV1%pred是评价哮喘严重程度分级的重要指标[1]。由此可见，ILC2s或能反映哮喘严重程度。

SMITH等[17]研究发现，EA在大剂量糖皮质激素作用下，ILC2s仍可通过局部不受控制地产生Th2型细胞因子IL-5、IL-13，从而促进哮喘患者EOS持续增多。但临床鲜见ILC2s与NEA关系的报道。本研究EA患者外周血ILC2s、IL-5水平显著高于NEA患者，但血浆IL-13水平与NEA患者比较差异无统计学意义。提示IL-5在EA的发病过程中可能具有重要作用。而NEA患者外周血ILC2s和Th2型细胞因子水平与健康志愿者比较差异均无统计学意义，说明NEA可能是一种非Th2型、非ILC2s介导的免疫反应。本研究EA患者外周血EOS计数显著高于NEA患者，进一步证实EA存在高嗜酸性粒细胞血症状态。EA患者与NEA患者外周血sIgE、tIgE水平比较差异均无统计学意义，但EA患者外周血ILC2s与外周血tIgE水平呈正相关关系。提示ILC2s或能参与调控tIgE产生。此外，EA患者与NEA患者FEV1%pred比较差异无统计学意义，EA患者FEV1/FVC明显低于NEA患者；相关性分析发现，EA患者外周血ILC2s与FEV1%pred呈负相关关系，与FEV1/FVC无明显相关性，NEA患者外周血ILC2s与FEV1%pred、FEV1/FVC均无明显相关性。但这并不能说明EA患者与NEA患者存在肺功能差异，需要进一步验证。

综上所述，外周血ILC2s可能通过介导Th2型细胞因子产生，参与AA、NAA和EA的发病过程，并可作为评估哮喘严重程度的指标，但其对NEA发病的影响不大。