粪便样本中高纯度人源DNA富集提取方法

吴帅帅，武云晖

（1.复旦大学 生命科学学院，上海 200433；2.上海迈景纳米科技有限公司，上海 200233）

据统计，癌症在人类70岁前是死亡的第一或第二原因，其中结直肠癌（Colorectal Cancer，CRC）发病率居第三位，死亡率居第二位[1-4]。有资料显示I、Ⅱ期大肠癌患者术后5年存活率在80%以上，但是晚期大肠癌患者术后5年存活率只有早期患者的1/5。因此，结直肠癌发病早期筛查对降低该疾病的发病率和死亡率具有重要意义[5-7]。研究显示，粪便样本中肠脱落细胞来源DNA基因甲基化检测对结直肠癌患者的检测灵敏度在90%以上，是进行结直肠癌早期非侵入性筛查的理想方案[8-10]。

由于粪便样本组分复杂且个体差异性大，导致粪便DNA基因检测结果的准确性和重现性差，严重制约了肠脱落细胞DNA检测技术在结直肠癌辅助诊断、早期筛查的应用，也对粪便样本DNA提取方法提出了更高的要求。

本研究对粪便样本的DNA提取试剂和流程进行了优化，通过对粪便样本的均质化处理，以及使用PVP等高分子交联剂预处理去除多糖、胆盐等生化物质，获得了高人源DNA比例的粪便DNA产物。同时比较了本方法与商业化核酸提取试剂盒在提取人源DNA比例上的差异，以及不同方法提取产物对PCR反应的抑制性。此外，还对结直肠癌患者粪便样本DNA提取产物和癌组织样本DNA提取产物的重亚硫酸盐转化测序（BSP）[11]结果进行了比对。

1 材料与方法

1.1 样本采集

粪便样本来源于接受体检的正常受试者和经病理检查确诊的结直肠癌患者，所有受试者采集样本前均已签署知情同意书。结直肠癌患者同时采集癌组织样本置于-80 ℃冻存。

1.2 仪器与试剂

Light Cycler 480Ⅱ PCR仪，罗氏公司；Nanodrop one超微量紫外分光光度计，赛默飞世尔科技（中国）有限公司。

Taqman Universal Master MixⅡ with UNG，Thermo Fisher Scientific；EZ DNA Methylation-Lightning Kit，ZYMO RESEARCH；组织基因组DNA提取试剂盒，TIANGEN；粪便基因组DNA快速提取试剂盒，Bioteke；粪便基因组DNA提取试剂盒，ZYMO RESEARCH。

1.3 粪便样本预处理、粪便DNA和组织DNA提取

（1）粪便样本预处理：粪便样本先经过均质化处理（采用高速研磨均质或颠倒混匀方式），将处理后的粪便上清置于-20 ℃冰箱预冷1 h，13 000×g离心3 min后吸取中间层上清液。向上清中加入4%的PVP交联剂后颠倒混匀，13 000×g离心3 min后弃去沉淀，上清液用于核酸提取。

（2）粪便DNA提取：取800 μL预处理后的粪便上清液加入裂解管中，震荡混匀后离心，转移全部上清后加入蛋白酶K和裂解液，70 ℃温育10 min，然后加入核酸结合液和氧化硅磁珠混匀2 min后弃去上清，加入500 μL洗涤液A和洗涤液B洗涤2次，最后使用100 μL的Low TE缓冲液从磁珠上洗脱吸附的DNA，-20 ℃条件下保存待用。

粪便DNA提取对比方法分别使用基于柱法提取（ZYMO REASARCH，D6010）和基于磁珠法提取的通用性核酸提取试剂盒（Bioteke，AU46212），所有操作均按照厂家提供的说明要求进行。

（3）组织DNA提取：使用组织基因组DNA提取试剂盒（TIANGEN），按照试剂盒说明书，取10 mg组织样本研磨匀浆后，加入蛋白酶K，在56 ℃温育10 min充分消化蛋白，然后分别加入裂解液和结合液处理，加入DNA洗涤液1和DNA洗涤液2去除试剂残留，最后使用Low TE缓冲液洗脱DNA。洗脱产物置于4 ℃短时保存或置于-20 ℃条件下保存待用。

1.4 DNA提取产物纯度和浓度检测

使用紫外分光光度计测定不同方法提取得到的粪便DNA和组织DNA产物浓度和纯度，分别以OD260/OD280和OD260/OD230表示。

1.5 粪便DNA中人源基因组DNA的定量（qPCR法）

选择管家基因β-Actin对粪便DNA中人基因组DNA进行定量分析。PCR引物和探针由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

正向引物序列：5′-TGGAGGAGGCTCAGCAAGTC-3′，反向引物序列：5′-CCACCACCCAGCACACAGT-3′，探针：5′VIC-TCTGGACTGTGAACCTG-3′MGB。

荧光定量PCR体系为20 μL，包括4 μL粪便DNA模 板，1×Taq PCR buffer，2 mmol/L的 MgCl2，300 mmol/L的 dNTPs，1 U 的 Taq DNA Polymerase，200 nmol/L的上下游引物、探针。

人源基因组DNA定量的PCR反应条件为：95 ℃预变性 5 min，95 ℃变性 30 s，65 ℃ 30s（VIC通道采集荧光信号），共50个循环。PCR结束后使用Light Cycler 480 Ⅱ仪器配套分析软件对采集的荧光信号进行分析，根据Cp值计算粪便DNA中人基因组DNA的含量。

1.6 粪便和组织样本甲基化特征的BSP验证

按照EZ DNA Methylation-Lightning Kit试剂盒说明书要求，取500 ng或不大于20 μL粪便DNA（组织DNA）转化模板。按照试剂盒说明书转化完成后使用15 μL M-Elution Buffer洗脱转化后模板DNA。

BSP正向引物序列：5′-TGTAGGAGAAGTYGGGTTGG-3′，反向引物序列：5′-AACTTTTCRAAACCCCRAAT-3′。

取4 μL转化产物加入甲基化测序PCR扩增体系：1×Taq PCR buffer，2 mmol/L的MgCl2，300 mmol/L的 dNTPs，1 U 的 Taq DNA Polymerase，200 nmol/L的上下游引物、探针。

BSP的PCR反应条件为：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性 30 s，65 ℃ 30s（-0.5 ℃ /循环），72℃ 20 s，然后再使用55 ℃退火条件扩增40循环，富集靶区域产物。PCR程序结束后将产物置于-20 ℃条件保存并外送测序公司测序。

2 结果与分析

2.1 粪便DNA中人基因组DNA定量

2.1.1 用于粪便样本中人ACTB基因定量的方法建立

本研究通过荧光定量PCR分析管家基因ACTB的含量，建立了分析粪便DNA中人源DNA的含量方法，结果如图1所示。图1A是10 000、5 000、1 000、200和100拷贝的标准物质PCR扩增曲线；图1B表明，标准曲线为Y=-3.008 7X+29.7600，本方法用于ACTB基因定量分析准确性良好，标准曲线的线性相关系数R2＞0.99。

图1 ACTB基因实时荧光定量PCR体系

2.1.2 不同均质化方法对人基因组DNA提取效率影响

对研磨均质与颠倒混匀均质处理后提取的粪便总DNA产率和人基因组DNA产率进行比较发现：研磨均质较颠倒混匀方式可以更充分地释放微生物DNA，研磨均质可以得到比颠倒混匀均质约3倍量的粪便总DNA；但是通过qPCR定量分析人基因组含量发现，研磨均质与颠倒混匀均质得到的人基因组DNA含量无显著差异，两者基本一致（图2A）。通过人基因组DNA含量及粪便总DNA含量分析计算可知：两种均质处理方式中，颠倒混匀均质处理得到的粪便总DNA中人基因组DNA比例更高，微生物DNA背景更少，更适用于基于粪便样本的人基因组DNA基因检测分析（图2B）。

图2 不同均质方法对粪便总DNA及人基因组DNA提取效率影响

2.2 粪便上清预处理对PCR抑制物去除效果的影响

对6例粪便样本3平行重复处理后提取粪便DNA，然后通过qPCR定量分析人β-Actin基因组含量发现，经过PVP预处理的粪便DNA均能有效扩增（Cp均值为20.53），且Cp值较未经PVP处理的粪便DNA扩增均值（Cp均值为21.69）明显减小（P＜0.01），未经预处理的粪便上清中有10个样品粪便DNA因PCR抑制干扰没有扩增信号（图3B）。因此，通过PVP溶液预处理上清可以获得纯度更高、潜在PCR抑制成分更少的粪便DNA。

图3 预处理措施对提取粪便DNA浓度和PCR抑制效果的影响

2.3 不同提取方法对人基因组DNA提取富集效率评价

通过比较不同粪便DNA提取方法提取的粪便DNA中人基因组DNA占总粪便DNA的比例评价粪便样本中人基因组DNA提取富集效率差异。使用4例来自不同个体的粪便样本，每份样本平均分成3份分别使用本研究优化提取方案、粪便基因组DNA快速提取试剂盒（Bioteke）、粪便基因组DNA提取试剂盒（ZYMO RESEARCH）进行粪便DNA提取，结果如图4所示。研究结果表明，商业化试剂盒柱法和磁珠法提取的粪便DNA中人基因组DNA比例基本一致，约占0.5%；本研究优化提取方案提取产物中人基因组DNA占比达6.62%；不同提取方法对粪便样本中人基因组DNA的相对富集作用差异显著（P≤0.01）。

图4 3种提取方法粪便DNA产物中人基因组DNA的比例

2.4 结直肠癌患者粪便和组织样本BSP结果比较

为进一步探索本研究中粪便DNA提取方案对临床样本的有效性，采用BSP方法继续测试了4例健康志愿者粪便样本和4例结直肠癌患者粪便样本和组织样本中靶基因甲基化结果。粪便样本DNA提取均采用本研究优化的人基因组DNA富集提取方案，一代测序服务由生工生物工程(上海)股份有限公司提供。

BSP测序结果显示：在4例结直肠癌患者粪便样本和组织样本平行比较中，有3例粪便DNA检测结果为阳性，1例为阴性（图5），粪便样本测序结果和对应组织样本测序结果完全一致；4例健康志愿者粪便样本测序结果3例阴性，1例阳性（图6）；8例粪便样本DNA均测序成功且测序结果和组织DNA测序结果一致，在临床样本中应用效果良好。

图5 4例结直肠癌患者粪便样本和组织样本平行比较BSP测序结果

图6 4例健康志愿者粪便样本BSP测序结果。

3 结论

得益于精准医学的发展，结直肠癌早诊、早治在降低癌症发病率和死亡率方面发挥着越来越重要的作用。结直肠癌患者基于粪便DNA的肿瘤生物标志物检测较FOBT、血清学检测等方法具有更高的灵敏度和特异性，但是粪便样本因成分复杂，简单高效制备高人源DNA比例、低PCR抑制性的产物还面临很多难题。本研究方案实现了人源DNA的相对富集提取，提取试剂可以有效去除粪便样本中的杂质成分，提高粪便DNA产物下游PCR检测的准确性和稳定性，在结直肠癌早期筛查领域具有良好的应用前景。